結腸癌術后感染患者外周血中CK19 mRNA轉錄與蛋白表達的意義

李恒 張東輝 劉丹璐

(西安市中心醫院結直腸外科，陜西 西安 710001)

結腸癌位居胃腸道腫瘤發病率的第三位，嚴重威脅人類生存健康。目前結腸癌首選的治療手段仍是以手術為主的綜合治療，但存在約35%的患者術后出現腫瘤復發和轉移情況，嚴重影響結腸癌患者的總體治愈率[1]。因此，早日明確結腸癌特異性腫瘤標記物，結合臨床個體化治療，最終達到減少結腸癌患者病死率的目的，是醫務工作者目前急需解決的棘手問題。研究[2]發現細胞角蛋白19(CK19)敏感性較高，其可在上皮性腫瘤組織中高表達，而在正常外周血、淋巴結等非上皮組織中低表達。同時，也有研究[3]發現CK19可能參與結腸癌的發生、發展過程，但其具體機制尚未明確。因此，本研究旨在探討結腸癌術后感染患者外周血中CK19 mRNA轉錄與蛋白表達的意義，并分析CK19 mRNA轉錄與蛋白表達情況與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2019年1月我院收治的結腸癌術后感染患者80例作為觀察組，另選取同期我院收治的結腸息肉患者80例作為對照組。所有患者均經相關病理學診斷，臨床資料完整，患者及家屬對本研究內容均知情同意，且所有患者術前均未接受放療、化療等；排除合并嚴重心、肝、腎等器質性疾病的患者，及合并其他內外科疾病和其他腫瘤疾病的患者等。其中觀察組男52例，女28例；年齡42～68歲，平均(45.52±2.81)歲；病程0.5～3年，平均(1.42±1.21)年。對照組男54例，女26例；年齡40～67歲，平均(43.68±1.82)歲；病程0.5～3.5年，平均(1.98±1.51)年。兩組患者的主要臨床一般資料比較無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審核并通過。

1.2主要試劑及儀器 總RNA提取試劑盒(北京康為世紀公司)、cDNA合成試劑盒(北京康為世紀公司)、實時熒光定量PCR試劑盒(北京康為世紀公司)、普通PCR儀(Bio-Rad公司)、7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)等。

1.3方法

1.3.1引物設計 依據CK19的基因序列設計引物、探針，采用Prasgfm Express2.0軟件進行引物設計[4]。CK19的上游引物為：5’-ATG TGG TTA CCG TTC CGG GCC-3’，下游引物為：5’-AGC TAT CGG TCC GTC AAG TA-3’，Taqman探針為FAM-5’-AGG TAC CTA CTG CGT CAC GGT CAT TCC AT-3’。

1.3.2總RNA提取 抽取患者外周靜脈血5 mL，加入枸櫞酸鈉抗凝，將其分離為單細胞后收集于離心管中，離心，10 000 r/min，5 min；棄上清，向下層沉淀加入Trizol提取液1 mL，混勻，加200 μL氯仿，混勻，離心，10 000 r/min，15 min；棄沉淀、取上清于離心管中，加異丙醇500 μL，混勻，離心，10 000 r/min，10 min；75%乙醇漂洗，加DEPC水30μL用于溶解RNA，最后在紫外分光光度計下測定RNA的濃度及純度。

1.3.3逆轉錄合成cDNA 逆轉錄的反應體積為20 μL，反應體系為：5×逆轉錄緩沖液4 μL，2 μL的dNTP(10 mmol/L)，RNasin 1μL(40U)，M-MLV逆轉錄酶1μL(200U)，OligodT15 1μL(1μg)，樣品總RNA 2μg，最后，加DEPC處理過的水至20 μL，混勻后置37℃環境中1 h，并于94℃條件下滅活M-MLV酶。

1.3.4RT-PCR擴增 PCR反應體系:逆轉錄產物2 μL，10×PCR反應緩沖液3 μL，CK19引物20 mol，Taq DNA酶1U，加DEPC處理過的水至30 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃ 90 s，進行35個循環。將PCR產物15 μL上樣于含0.5 μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，電泳，5 V/cm，40 min，最后，于紫外燈下觀察并拍攝記錄CK19 mRNA表達情況，并分析其與患者臨床病理特征的關系。

1.3.5酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測CK19蛋白的表達水平 采集結腸癌術后感染患者外周靜脈血3 mL，離心，3 000 r/min，15 min，取上清，采用ELISA檢測CK19蛋白表達水平，并分析外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關系。

1.4觀察指標 統計兩組CK19 mRNA的陽性表達率；外周血CK19 mRNA陽性表達情況與患者臨床病理特征的關系；外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關系。

2 結 果

2.1CK19 mRNA陽性表達率 觀察組中CK19 mRNA的陽性表達率為83.75%，對照組中CK19 mRNA的陽性表達率為27.50%，兩組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者CK19 mRNA陽性表達率比較[n(%)]

2.2外周血CK19 mRNA表達情況與患者臨床病理特征的關系 結腸癌術后感染患者外周血CK19 mRNA陽性表達情況與患者的性別和年齡均無明顯相關性(P>0.05)；處于C或D分期、低分化和有淋巴結轉移患者的外周血CK19 mRNA陽性表達分別顯著高于A或B分期、中高分化和無淋巴結轉移的患者(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 外周血CK19 mRNA表達情況與患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關系 結腸癌術后感染患者外周血CK19蛋白表達情況與患者性別和年齡均無明顯相關性(P>0.05)；處于C或D分期、低分化和有淋巴結轉移的患者外周血CK19蛋白表達水平分別顯著高于A或B分期、中高分化和無淋巴結轉移的患者(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關系

3 討 論

結腸癌發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，成為威脅人類生存健康的常見消化道惡性腫瘤。隨著醫療衛生條件的改善，結腸癌的治愈率并未得到顯著提高，目前仍以手術治療為主，但大部分患者易發生術后感染，且對于已出現腫瘤轉移的患者，預后較差，并且常規的檢查手段難以及時發現轉移情況[5]。因此，盡快明確結腸癌的早期篩選標志物以及尋找有效的治療方法顯得尤為重要。

CK19是上皮細胞重要的中間纖維，其表達方式的不同反映著上皮細胞分化的不同途徑。研究[6]發現，大部分癌細胞分化后仍會保留起源細胞的CKs類型，提示可通過測定CKs的類型進而確定癌細胞的起源，指導擬定針對性的治療方案。目前，CK19與腫瘤相關的臨床參數已成為研究熱點。資料[7]顯示，CK19表達具有特異性，在正常骨髓、血液、淋巴結中未發現CK19表達，而在結、直腸癌中CK19卻呈現高表達，因此，CK19也被認為具有診斷是否發生腫瘤轉移的作用。本研究結果顯示，觀察組患者CK19陽性表達67例，陽性率為83.75%，對照組CK19陽性表達22例，陽性率為27.50%，兩組比較有顯著性差異，提示CK19 mRNA的陽性表達情況可能與結腸癌發生有一定的相關性。

CK19在判斷腫瘤分期、分化程度及微轉移情況相關研究中具有至關重要的作用。研究[8]發現，CK19是檢測乳腺癌外周血腋窩淋巴結及骨髓等組織中是否存在隱匿轉移的可靠標志物。有研究[9]表明，通過檢測乳腺癌患者外周血中CK19 mRNA轉錄與蛋白表達情況可對乳腺癌的早期診斷及預后等進行判斷。研究[10]顯示，肝癌患者CK19陽性表達的細胞具有增殖能力強、惡性程度高、侵襲力強及預后差等特征。此外，有研究[11-13]報道，在胃癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤的檢測中，CK19可作為腫瘤檢測的特異標志物。同時，也有研究[14]發現，根據結腸癌患者外周血CK19 mRNA轉錄與蛋白表達水平有助于監測結腸癌微轉移情況。本研究結果顯示，結腸癌術后感染患者外周血CK19 mRNA轉錄與蛋白表達水平與患者的性別和年齡均無明顯相關性，而與患者Dukes分期、分化程度及淋巴結轉移情況有關，且與處于A或B分期、中高分化和無淋巴結轉移患者相比，處于C或D分期、低分化和有淋巴結轉移患者的外周血CK19 mRNA陽性表達和蛋白表達水平均顯著升高，提示檢測外周血中CK19 mRNA轉錄與蛋白表達水平，可推斷患者外周血中是否有腫瘤細胞，判斷是否存在腫瘤微轉移，進而可指導結腸癌的早期干預，制定個體化的治療措施，尤其對已發生腫瘤轉移的患者，可以指導其臨床診斷和治療。

綜上，結腸癌術后感染患者CK19 mRNA陽性表達率較高，且CK19 mRNA轉錄及蛋白表達水平與腫瘤的分期、分化程度及淋巴結轉移情況具有明顯相關性，這在結腸癌病變的早期診斷中具有指導性意義。