高效液相色譜法測定香腸中脫氫乙酸的不確定度評定

孫愛玲，劉 葉

（壹諾（天津）檢測服務有限公司，天津 300383）

脫氫乙酸，一種典型的防腐化學藥品，對霉菌及酵母菌具有很強的抑制作用，是我國食品防腐行業不可缺少的重要化學品之一。盡管脫氫乙酸毒性低，但是短時間內過量服用還是有一定風險，會對人們的中樞神經和肝腎造成傷害，在嚴重的情況下甚至可能具有一定的致癌風險[1]。所以，對脫氫乙酸的監督管理和日常檢測也是至關重要的。我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中對此進行了嚴格的規定，在熟肉制品中脫氫乙酸的使用量最大不可超過0.5 g/kg（以脫氫乙酸計）。對不確定度進行評估是衡量檢驗結果是否準確的重要指標，在很大程度上體現了測定結果的可信度以及實驗室的檢測水平[2]。本文主要以《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[3]為依據，使用其中的第二種方法，對火腿中脫氫乙酸含量進行測試，并對結果進行不確定評估。通過對不確定度來源及影響因素的論述，為結果的準確性提供依據，并為未來的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260（紫外檢測器）。

脫 氫 乙 酸 標 準 物：N-11578-1G，CHEM SERVICE；甲醇、乙酸銨：Fisher Chemical，色譜純；硫酸鋅、氫氧化鈉：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 實驗方法

根據GB 5009.121—2016 中所涉及的第二種方法對進行樣品前處理。首先準確稱取均勻樣品2.5 g，將其加入50 mL 離心管。再加入5 mL 硫酸鋅（120 g/L）、10 mL H2O， 用20 g/L NaOH 調節溶液pH 值為7.5。然后，準備一個25 mL 的容量瓶，并將上述混合溶液轉移至其中。再加入溶劑至刻度完成定容后，將混合液在超聲波機中進行超聲10 min，以使其進一步均勻混合。然后，使用一次性吸管將該混合溶液轉移到分液漏斗中，并且在其中加入10 mL 的正己烷，搖勻此溶液后將其靜置。靜置過后的溶液分為兩層，丟棄上層正己烷層，并且在分液漏斗中再次添加10 mL 的正己烷溶液，再一次重復上述操作以得到較好的效果。最后，取出下層的水相溶液，將其置于提前準備好的干凈的離心管中進行離心10 min。然后在0.45 μm 濾膜上過濾上清液，并將其放在一旁備用。

1.3 液相色譜檢測條件

色譜柱：ODS-3 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨（10 ∶90）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.4 標準曲線的配制

在燒杯中準確稱取0.05 g 脫氫乙酸標準品，在此標準品中加入5 mL NaOH（20 g/L）溶液，攪拌使其充分溶解，并將溶解后的溶液轉移至50 mL 容量瓶，加入適量的水將其進行定容后便可以得到后續實驗所需要的標準儲備液，其濃度為1 000 μg/mL。然后，分別移取儲備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 于10 mL 容量瓶，按照操作規程加溶劑到所需要的刻度進行定容。定容后將溶液進行搖晃混合均勻，并將其配制成標準溶液以待下一步的測定。

1.5 數學模型

測量結果計算公式如下：

式中：X為脫氫乙酸的含量，g/kg；m為樣品質量，g；C1為脫氫乙酸的濃度，μg/mL；C0為空白樣品的脫氫乙酸濃度，μg/mL；V為定容體積，mL。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據筆者所建立的數學模型可以知道，結果的不確定性來源主要包括藥品的稱量、溶液的定容、標準工作曲線溶液的配制與曲線擬合、儀器的精密度以及樣品的重復性測定。

2.2 樣品稱量導致的不確定度

（1）將樣品稱樣兩次，天平的最大允差為±0.000 1 g，區間半寬度為0.000 1 g，按均勻分布,那么由天平誤差引入的不確定度為：

（2）所用天平的分辨率為0.000 1 g，區間半寬度為0.000 05 g，按均勻分布，那么由天平分辨率引入的不確定度為：

則樣品稱量引入的合成不確定度為u(m)==8.7×10?5g，相對標準不確定度為=3.5×10?5。

2.3 樣液定容導致的不確定度

本研究中所使用的25 mL 的容量瓶所具有的最大允差是±0.03 mL， 按照均勻分布，則由容量瓶引入的相對不確定度為u(V25mL)==0.017。

實驗室的溫度為（20±5）℃，溫度的波動會影響容量瓶和溶劑的體積。20 ℃時容量瓶的膨脹系數為2.5×10-5/℃，遠小于水的膨脹系數2.1×10-4/℃，因此可忽略容量瓶的體積變化，按均勻分布，則由溫度變化引入的不確定度為：

則樣液定容時的合成不確定度為u(V)==0.023 mL，相對標準不確定度為=9.2 ×10?4。

2.4 標準溶液配制產生的不確定度

2.4.1 標準物質引入的不確定度

根據證書，脫氫乙酸（99.5%）的相對標準不確定度為±0.5%，包含因子k=2， 則urel(c')==0.002 5。

2.4.2 標準工作液配制產生的不確定度

（1）移液器引入的不確定度。依據計量證書提供的數據，按均勻分布，計算各移液器引入的相對不確定度如表1 所示。

表1 移液器引入的相對標準不確定度

移液器引入的合成相對標準不確定度為：

（2）容量瓶引入的不確定度。根據器材臺賬，本論文所使用的10 mL 容量瓶允差是±0.02 mL，50 mL 容量瓶允差是±0.05 mL,按均勻分布，則容量瓶引入的相對不確定度為urel(V10mL)==0.001 2，urel(V50mL)==0.000 58。

20 ℃時水的膨脹系數2.1×10-4/℃，溫度（20±5）℃，按均勻分布，則u=00..000000 6611。

則標準溶液定容時，10 mL 和50 mL 容量瓶引入的合成相對不確定度分別為：

標準溶液配制過程中容量瓶引入的合成相對不確定度為：

因此，合成標準物質配制產生的相對不確定度為：

2.4.3 標樣稱量引入的不確定度

則標樣稱量導致的合成不確定度為：

相對標準不確定度為：

因此，標準工作溶液引入的相對標準不確定度為：

2.5 儀器定量引入的不確定度

樣品進樣量為10 μL，查得高效液相色譜的允許誤差為6.3%， 按均勻分布， 則urel(q)==0.003 6。

2.6 標準工作曲線擬合引入的標準不確定度

工作液濃度為1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 和200 mg/L 時，峰面積Y分別為7.068、70.068、345.800、711.150 和1 381.900。曲線回歸方程為Y=6.9483 4X，R=0.999 94。

標準曲線擬合引入的標準不確定度計算公式如下：

式中：S(Y)為標準曲線的標準差；P為樣品溶液的測定次數；N為標準溶液的測定次數；b為標準曲線的斜率；cx為樣品溶液中待測物的濃度，mg/L；為標準溶液濃度的平均值，mg/L；ci為標準溶液的濃度，mg/L；Yi為單次標準溶液的響應值。

2.7 樣品測定重復性引入的不確定度

對香腸中脫氫乙酸含量進行10 次重復測定，根據計算公式得出結果分別為0.151 g/kg、0.151 g/kg、0.156 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.152 g/kg、0.156 g/kg 和0.150 g/kg。

2.8 合成不確定度

將上述各分量合成相對標準不確定度為：

合成標準不確定度為：

u(Y)=0.153×0.103=0.016 g/kg

2.9 擴展不確定度及測定結果報告

95%置信概率下取包含因子k=2，將合成標準不確定度乘以包含因子計算得到脫氫乙酸測量結果的擴展不確定度為U=u(Y)×k=0.032 g/kg。

因此可以得出結論，香腸中脫氫乙酸的含量是（0.153±0.032）g/kg，k=2。

3 結論

本文以國家標準文件為理論依據，使用液相色譜法對香腸中所含有的脫氫乙酸含量進行了準確的測量。與此同時，對測定結果可能出現的不確定度來源的主要因素進行了合理的考察，并基于數學模型進行了準確計算。研究發現，標準溶液的配制、曲線的擬合和樣品的重復測定是影響結果不確定度的主要因素，樣品前處理過程中的稱量、定容對不確定度的影響較小。因此，實驗中要嚴格遵守操作規程，使用有證標準物質，對儀器設備進行定期檢定和期間核查，提升專業人員的技術水平，是提高檢測結果準確性的前提。