高效液相色譜法測(cè)定香腸中脫氫乙酸的不確定度評(píng)定

孫愛玲，劉 葉

（壹諾（天津）檢測(cè)服務(wù)有限公司，天津 300383）

脫氫乙酸，一種典型的防腐化學(xué)藥品，對(duì)霉菌及酵母菌具有很強(qiáng)的抑制作用，是我國食品防腐行業(yè)不可缺少的重要化學(xué)品之一。盡管脫氫乙酸毒性低，但是短時(shí)間內(nèi)過量服用還是有一定風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)人們的中樞神經(jīng)和肝腎造成傷害，在嚴(yán)重的情況下甚至可能具有一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。所以，對(duì)脫氫乙酸的監(jiān)督管理和日常檢測(cè)也是至關(guān)重要的。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中對(duì)此進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，在熟肉制品中脫氫乙酸的使用量最大不可超過0.5 g/kg（以脫氫乙酸計(jì)）。對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)估是衡量檢驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確的重要指標(biāo)，在很大程度上體現(xiàn)了測(cè)定結(jié)果的可信度以及實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平[2]。本文主要以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）[3]為依據(jù)，使用其中的第二種方法，對(duì)火腿中脫氫乙酸含量進(jìn)行測(cè)試，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行不確定評(píng)估。通過對(duì)不確定度來源及影響因素的論述，為結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)，并為未來的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260（紫外檢測(cè)器）。

脫 氫 乙 酸 標(biāo) 準(zhǔn) 物：N-11578-1G，CHEM SERVICE；甲醇、乙酸銨：Fisher Chemical，色譜純；硫酸鋅、氫氧化鈉：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)GB 5009.121—2016 中所涉及的第二種方法對(duì)進(jìn)行樣品前處理。首先準(zhǔn)確稱取均勻樣品2.5 g，將其加入50 mL 離心管。再加入5 mL 硫酸鋅（120 g/L）、10 mL H2O， 用20 g/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為7.5。然后，準(zhǔn)備一個(gè)25 mL 的容量瓶，并將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至其中。再加入溶劑至刻度完成定容后，將混合液在超聲波機(jī)中進(jìn)行超聲10 min，以使其進(jìn)一步均勻混合。然后，使用一次性吸管將該混合溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并且在其中加入10 mL 的正己烷，搖勻此溶液后將其靜置。靜置過后的溶液分為兩層，丟棄上層正己烷層，并且在分液漏斗中再次添加10 mL 的正己烷溶液，再一次重復(fù)上述操作以得到較好的效果。最后，取出下層的水相溶液，將其置于提前準(zhǔn)備好的干凈的離心管中進(jìn)行離心10 min。然后在0.45 μm 濾膜上過濾上清液，并將其放在一旁備用。

1.3 液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：ODS-3 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨（10 ∶90）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：293 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

在燒杯中準(zhǔn)確稱取0.05 g 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，在此標(biāo)準(zhǔn)品中加入5 mL NaOH（20 g/L）溶液，攪拌使其充分溶解，并將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，加入適量的水將其進(jìn)行定容后便可以得到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需要的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其濃度為1 000 μg/mL。然后，分別移取儲(chǔ)備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 于10 mL 容量瓶，按照操作規(guī)程加溶劑到所需要的刻度進(jìn)行定容。定容后將溶液進(jìn)行搖晃混合均勻，并將其配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液以待下一步的測(cè)定。

1.5 數(shù)學(xué)模型

測(cè)量結(jié)果計(jì)算公式如下：

式中：X為脫氫乙酸的含量，g/kg；m為樣品質(zhì)量，g；C1為脫氫乙酸的濃度，μg/mL；C0為空白樣品的脫氫乙酸濃度，μg/mL；V為定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)筆者所建立的數(shù)學(xué)模型可以知道，結(jié)果的不確定性來源主要包括藥品的稱量、溶液的定容、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的配制與曲線擬合、儀器的精密度以及樣品的重復(fù)性測(cè)定。

2.2 樣品稱量導(dǎo)致的不確定度

（1）將樣品稱樣兩次，天平的最大允差為±0.000 1 g，區(qū)間半寬度為0.000 1 g，按均勻分布,那么由天平誤差引入的不確定度為：

（2）所用天平的分辨率為0.000 1 g，區(qū)間半寬度為0.000 05 g，按均勻分布，那么由天平分辨率引入的不確定度為：

則樣品稱量引入的合成不確定度為u(m)==8.7×10?5g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=3.5×10?5。

2.3 樣液定容導(dǎo)致的不確定度

本研究中所使用的25 mL 的容量瓶所具有的最大允差是±0.03 mL， 按照均勻分布，則由容量瓶引入的相對(duì)不確定度為u(V25mL)==0.017。

實(shí)驗(yàn)室的溫度為（20±5）℃，溫度的波動(dòng)會(huì)影響容量瓶和溶劑的體積。20 ℃時(shí)容量瓶的膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃，遠(yuǎn)小于水的膨脹系數(shù)2.1×10-4/℃，因此可忽略容量瓶的體積變化，按均勻分布，則由溫度變化引入的不確定度為：

則樣液定容時(shí)的合成不確定度為u(V)==0.023 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=9.2 ×10?4。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)證書，脫氫乙酸（99.5%）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±0.5%，包含因子k=2， 則urel(c')==0.002 5。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制產(chǎn)生的不確定度

（1）移液器引入的不確定度。依據(jù)計(jì)量證書提供的數(shù)據(jù)，按均勻分布，計(jì)算各移液器引入的相對(duì)不確定度如表1 所示。

表1 移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

移液器引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）容量瓶引入的不確定度。根據(jù)器材臺(tái)賬，本論文所使用的10 mL 容量瓶允差是±0.02 mL，50 mL 容量瓶允差是±0.05 mL,按均勻分布，則容量瓶引入的相對(duì)不確定度為urel(V10mL)==0.001 2，urel(V50mL)==0.000 58。

20 ℃時(shí)水的膨脹系數(shù)2.1×10-4/℃，溫度（20±5）℃，按均勻分布，則u=00..000000 6611。

則標(biāo)準(zhǔn)溶液定容時(shí)，10 mL 和50 mL 容量瓶引入的合成相對(duì)不確定度分別為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中容量瓶引入的合成相對(duì)不確定度為：

因此，合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.4.3 標(biāo)樣稱量引入的不確定度

則標(biāo)樣稱量導(dǎo)致的合成不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 儀器定量引入的不確定度

樣品進(jìn)樣量為10 μL，查得高效液相色譜的允許誤差為6.3%， 按均勻分布， 則urel(q)==0.003 6。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

工作液濃度為1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 和200 mg/L 時(shí)，峰面積Y分別為7.068、70.068、345.800、711.150 和1 381.900。曲線回歸方程為Y=6.9483 4X，R=0.999 94。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式如下：

式中：S(Y)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；P為樣品溶液的測(cè)定次數(shù)；N為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；cx為樣品溶液中待測(cè)物的濃度，mg/L；為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值，mg/L；ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/L；Yi為單次標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。

2.7 樣品測(cè)定重復(fù)性引入的不確定度

對(duì)香腸中脫氫乙酸含量進(jìn)行10 次重復(fù)測(cè)定，根據(jù)計(jì)算公式得出結(jié)果分別為0.151 g/kg、0.151 g/kg、0.156 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.152 g/kg、0.156 g/kg 和0.150 g/kg。

2.8 合成不確定度

將上述各分量合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(Y)=0.153×0.103=0.016 g/kg

2.9 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果報(bào)告

95%置信概率下取包含因子k=2，將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子計(jì)算得到脫氫乙酸測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為U=u(Y)×k=0.032 g/kg。

因此可以得出結(jié)論，香腸中脫氫乙酸的含量是（0.153±0.032）g/kg，k=2。

3 結(jié)論

本文以國家標(biāo)準(zhǔn)文件為理論依據(jù)，使用液相色譜法對(duì)香腸中所含有的脫氫乙酸含量進(jìn)行了準(zhǔn)確的測(cè)量。與此同時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果可能出現(xiàn)的不確定度來源的主要因素進(jìn)行了合理的考察，并基于數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了準(zhǔn)確計(jì)算。研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、曲線的擬合和樣品的重復(fù)測(cè)定是影響結(jié)果不確定度的主要因素，樣品前處理過程中的稱量、定容對(duì)不確定度的影響較小。因此，實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行定期檢定和期間核查，提升專業(yè)人員的技術(shù)水平，是提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。