氣相色譜法測(cè)定腌蘿卜中甜蜜素不確定度分析報(bào)告

羅慈婷

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

甜蜜素是一種化學(xué)甜味劑，主要用于提高食品的甜度，其效果和口感良好，被應(yīng)用于我國(guó)的食品加工業(yè)。常用的食品甜蜜素檢測(cè)方法有色譜法[1]。適量的甜味劑能夠賦予食品更舒適的味道，但過量添加會(huì)對(duì)人體健康造成不良影響。甜蜜素在體內(nèi)不參與機(jī)體代謝，大劑量攝入會(huì)導(dǎo)致腹瀉，造成胃腸道損傷，加重人體肝臟負(fù)擔(dān)，并具有潛在致癌性[2]。甜蜜素根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）的規(guī)定，腌漬的蔬菜其最大使用量為1.0 g/kg。按照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》分析不確定度的因素并統(tǒng)計(jì)相關(guān)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

腌蘿卜，購(gòu)自番禺區(qū)超市。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

甜蜜素（純度≥99.4%，Dr.Ehrenstorfer）、正庚烷、亞硝酸鈉、硫酸與氯化鈉。

1.3 儀器設(shè)備

氣相色譜儀；天平；離心機(jī)；超聲機(jī)；旋渦混合器。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試劑配制

（1）環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.0 mg/mL）的配制。稱取141.53 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至25.0 mL，混勻[3]。

（2）標(biāo) 準(zhǔn) 使 用 液（1.0 mg/mL）的 配 制。移 取20.0 mL 己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至100 mL[3]。移取1.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、10.00 mL 以及25.00 mL于50 mL 容量瓶中，加水定容，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)使用液臨用時(shí)配制以備衍生化用。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10.0 mL，按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》（GB 5009.97—2016）第一法衍生化操作[3]。

1.4.2 測(cè)定方法

按GB 5009.97—2016 第 一 法， 用Agilent 7890B氣相色譜儀測(cè)定腌蘿卜中甜蜜素的含量，經(jīng)過水提取定容，取10 mL 樣液衍生化操作后，取上清液供氣相色譜測(cè)定[3]。

1.4.3 色譜條件

升溫程序：按GB 5009.97—2016 要求，初始溫度為55 ℃，以10 ℃/min 的速率升溫至95 ℃后保持0.5 min，再以30 ℃/min 升溫至200 ℃后保持3 min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；流速：5.0 mL/min；氫氣流量：40 mL/min；空氣流量：350 mL/min[3]。

1.4.4 數(shù)學(xué)模型

甜蜜素的數(shù)學(xué)模型為：

式中：X為甜蜜素含量，g/kg；C為甜蜜素的濃度，mg/mL；V3為正庚烷定容體積，mL；m樣為待測(cè)樣品的取樣量，g；V1為樣品處理后定容體積，mL；V2為萃取甜蜜素所取試樣液體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)測(cè)定方法的主要步驟，不確定度主要來(lái)源于：①標(biāo)準(zhǔn)品；②天平使用過程；③定容及移取過程；④擬合曲線；⑤儀器及多次測(cè)量重復(fù)性等引入。具體見圖1。

圖1 甜蜜素不確定度來(lái)源

2.2 不確定度計(jì)算過程

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的提供商為Dr.Ehrenstorfer，該標(biāo)物證書純度99.12%，擴(kuò)展不確定度為4.48%，為正態(tài)分布，包含因子k=2，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=2.24%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0226。

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度。使用天平稱取甜蜜素141.53 mg 的標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容至25 mL 容量瓶，查驗(yàn)其證書得知擴(kuò)展不確度U=0.04 mg（k=2），其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.02mg ，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000142；查閱《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），A 級(jí)25 mL容量瓶的容量允許差為±0.030 mL[4]，，則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0174mL ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000696；玻璃器皿使用過程中引起的不確定性用計(jì)算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)評(píng)估。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，由溫度起 伏 引 起 體 積 偏 差 為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00122；于是由儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的不確定度。使用10 mL移液槍移取5.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 mL，用水定 容 至50 mL 容 量 瓶， 得1.000 mg/mL 標(biāo) 準(zhǔn) 中間 液。 按JJG 646—2006 規(guī) 定， 使 用1 ～10 mL移液槍時(shí)，其中10 mL 規(guī)格容量允許誤差為±0.6%[5]，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347；在20 ℃校準(zhǔn)移液槍時(shí)， 溫 度 在（20±5） ℃起 伏， 此 過 程 引 起 的不確定度用該溫度范圍系數(shù)來(lái)評(píng)定，水的體 積 膨 脹 系 數(shù) 為2.1×10-4℃-1， 當(dāng) 溫 度 起 伏時(shí) 引 起 體 積 偏 差 為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00122；根據(jù)JJG 196—2006，容量瓶為A 級(jí)50 mL 的容量允許差為±0.05 mL[4]，，此過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0289mL ，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000578；在20 ℃校準(zhǔn)玻璃器皿，溫度在（20±5） ℃起伏。此過程引起的不確定度用溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)評(píng)定。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由于溫度起伏引起體積偏差為V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(P2D)==0.00122；溶液稀釋配制過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。合成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由物質(zhì)純度、儲(chǔ)備液配制和中間液配制過程中引入，則合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品稱量

依據(jù)GB 5009.97—2016，使用天平稱取樣品5.00 g，該天平檢定證書給出的0～50 g（0～50 000e，e=10 d，d=1 mg）稱量范圍的允許誤差MPE=±0.5 mg，用5 g砝碼校正天平，由檢定證書給出的擴(kuò)展不確定度為Us=0.03 mg(k2=2)，用天平分別稱取腌蘿卜6 次，結(jié)果數(shù)據(jù)分別為5.002 4 g、5.002 1 g、5.002 4 g、5.002 3 g、5.002 3 g 和5.001 8 g，均值為5.002 2 g，方差S2=0.000 000 053 7。算得其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 前處理萃取和定容試液

（1）樣品處理后容量瓶定容體積引入的不確定度。用樣液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水定容。按JJG 196—2006 規(guī)定，（A 級(jí)）50 mL 容量瓶的容量允許差為±0.05 mL[4]，，此過程的引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0289mL ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.000578；在20 ℃校準(zhǔn)玻璃器皿，實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±5） ℃起伏。玻璃器皿的體積膨脹明顯小于液體，因此只考慮溫度變化即可。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由溫度起伏引起體積偏差為V1×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由溫度起伏引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品合成處理后容量瓶定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）衍生化試液引入的不確定度。用10 mL 移液槍移取10 mL 上清液進(jìn)行衍生化。按JJG 646—2006規(guī)定，使用1 ～10 mL 移液器時(shí)，其中10 mL 規(guī)格檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±0.6%[5]，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347；在20 ℃校準(zhǔn)移液槍，溫度在（20±5） ℃起伏，此過程引起的不確定度可用溫度范圍系數(shù)來(lái)評(píng)定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，由溫度起伏引起的體積偏差為V2×10 ℃×2.1×10-4℃-1，，由溫度起伏引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(V2B)==0.00122，合成甜蜜素衍生化所取試樣液體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）正庚烷試液引入的不確定度。用10 mL 移液器移取5 mL 正庚烷定容，按JJG 196—2006[4]規(guī)定，使用1 ～10 mL 移液器時(shí)，5 mL 規(guī)格檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±0.6%，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00347。在20 ℃校準(zhǔn)移液槍，溫度在（20±5） ℃起伏。此過程的不確定度用溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)評(píng)定。正庚烷的體積膨脹系數(shù)為1.24×10-3℃-1，由溫度起伏引起體積偏差為V3×10 ℃×1.24×10-3℃-1，，此過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(V2B)==0.00716；正庚烷定容體積引起的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）樣品前處理試液引入的不確定度。樣品前處理的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由樣品處理后定容、甜蜜素衍生化所取試樣液、正庚烷定容體積引入，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 樣品濃度試液引入的不確定度利用校準(zhǔn)曲線來(lái)表示甜蜜素的濃度，配制6 個(gè)校準(zhǔn)溶液的濃度分別為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL 和0.50 mg/mL。根據(jù)以上數(shù)據(jù)得到平均值為=0.1467mg/mL，每個(gè)點(diǎn)各測(cè)量3 次，峰面積和濃度測(cè)定結(jié)果見表1，根據(jù)表1 進(jìn)行線性回歸方程式擬合，結(jié)果見表2。

表1 峰面積和濃度測(cè)定結(jié)果

表2 檢出限和線性范圍結(jié)果

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的確定度為：

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)偏差；Aj為對(duì)應(yīng)峰面積；a為曲線截距；b為曲線斜率；cj為甜蜜素濃度點(diǎn)；n為測(cè)定次數(shù)；p為測(cè)定次數(shù)。

提取樣品溶液，濃度分別為0.304 0 mg/mL 和0.291 9 mg/mL，即平均值為c=0.298 mg/mL，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.00544。

2.2.5 重復(fù)性引入的不確定度

（1）儀器重復(fù)性引入的不確定度。用混合均勻的同一個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，得出甜蜜素的含量分別為2.88 g/kg、2.83 g/kg、2.85 g/kg、2.84 g/kg、2.89 g/kg和2.86 g/kg，均值為2.86 g/kg。測(cè)量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，此工程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確度為：

（2）其他因素引入的不確定度。影響檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性的因素主要有人員操作、讀數(shù)差異、測(cè)量?jī)x器的變動(dòng)性和樣品不均勻等[5-6]。檢驗(yàn)員用相同的一臺(tái)儀器進(jìn)樣，對(duì)混勻的同一批次腌蘿卜進(jìn)行了6 次重復(fù)試驗(yàn)，甜蜜素含量分別為2.82 g/kg、2.90 g/kg、2.69 g/kg、2.78 g/kg、2.91 g/kg 和2.73 g/kg。 測(cè)量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，。本次測(cè)量2=0.0892g/kg個(gè)樣品，平均值為2.86 g/kg，本次測(cè)量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.0631g/kg ，此過程的平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

重復(fù)性測(cè)量引入的合成相對(duì)不確定度為：

2.2.6 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品稱量、樣品萃取和定容、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度以及重復(fù)性試驗(yàn)5個(gè)方面的操作引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.7 相對(duì)擴(kuò)展

置信概率為95%時(shí)，取包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=k×ucrel(W)=2×0.033 8=6.8%。

樣品甜蜜素為2.86 g/kg,則其拓展不確定度U=2.86 g/kg×6.8%=0.19 g/kg。

3 結(jié)論

根據(jù)不確定度評(píng)估后，甜蜜素測(cè)定結(jié)果為2.86 g/kg，U=0.19 g/kg，k=2。由此得出，每個(gè)環(huán)節(jié)操作都對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，所以應(yīng)避免檢驗(yàn)過程中人為造成的誤差，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。