骨組織工程學中復合支架及其應用研究進展

彭鑫，彭中華，譚奇超，龐河，譚榮雄，蔡杰欽，吳曉慧，魏波，李文慶

(1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524000； 2.茂名市人民醫院超聲科，廣東 茂名 525000；3.深圳市南山區人民醫院手足外科，廣東 深圳 518000)

骨不愈合是骨損傷修復的難點，導致骨不愈合的因素主要包括慢性感染性疾病(如結核)、惡性侵襲性疾病(如骨腫瘤)、骨折合并軟組織破壞(如大面積開放性骨折)以及患者自身因素(如老年人或免疫功能低下)等[1]。植骨是骨折延遲愈合、不愈合的有效治療手段之一，主要包括患者自體骨移植(如作為皮質骨移植物的髂骨移植、帶有血運的腓骨移植)、同種異體骨移植(如脫鈣骨基質)和骨替代品移植(如磷酸鈣水泥、陶瓷及其復合物、骨誘導生長因子、生物活性復合材料)等。其中，作為“金標準”的自體骨移植具有取骨部位疼痛、增加感染概率、來源有限等缺點，而同種異體骨移植具有免疫反應和疾病傳播的潛在風險[2]。因此，骨組織工程學作為潛在替代方法已成為骨重建的主要策略。生物材料支架是骨組織工程學的核心，目前3D打印已成為制備生物支架的流行技術[3]。通過3D打印技術可打印具有生物兼容性且符合患者特定病灶形態的復合支架，不僅在形狀上與缺損骨接近，還可模擬與骨組織相似的孔狀結構和力學特性。現就骨組織工程學中復合支架及其應用研究進展予以綜述。

1 復合支架的要求

研究者普遍認為，支架可作為臨時的機械結構用以模仿骨骼組織中的細胞外基質[4]，從而加速骨的再生修復過程。在骨的移植修復中，常將聚合物和陶瓷作為復合支架的材料組成。天然骨組織是由羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)和膠原纖維基質組成的復合物，在組織工程應用中最常見的復合材料是結合了高分子材料與陶瓷材料的復合材料，如聚合物/陶瓷復合支架，聚合物可提供良好的彈性強度和抗彎曲性，陶瓷則提供支架的壓縮強度、降解率和成骨能力[5]。因此，陶瓷和生物玻璃礦物被添加到天然和合成聚合物中，如磷酸三鈣(tricalcium phosphatec，TCP)/磷酸四鈣聚合物、β-TCP/生物玻璃、HA/明膠、HA/淀粉、聚己內酯(poly caprolactone，PCL)/HA等[6]。一個好的支架需要具備的屬性主要包括：①具有良好的表面滲透性，可轉移生物的相關信號成分，同時還應具有一定的機械力學強度，且最好與天然骨組織相近[7]；②具有合適的孔徑和表面粗糙度，以促進相關細胞附著或誘導其向成骨方向分化[8]；③具有良好的生物相容性，可最大限度地降低局部毒性和不良免疫/炎癥反應的風險[9-10]。

2 復合支架的材料

2.1天然聚合物 多糖、蛋白質、淀粉、藻酸鹽、透明質酸等均具有天然的生物相容性，且與陶瓷相比質地較軟，可適應所需形狀的要求；此外，天然聚合物還包含特定的分子結構域，是細胞發育不同階段發送重要信號的區域，可在細胞發育的各階段支持和引導細胞分泌更多相關的細胞外基質[11]，從而增強支架與組織的生物相互作用。Maciel等[12]用殼聚糖與殼聚糖/纖維蛋白原共聚物分別干預人巨噬細胞，結果發現用殼聚糖/纖維蛋白原共聚物干預的巨噬細胞產生了大量重要因子和血管生成介質，如骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-7、成纖維細胞生長因子-7和血小板衍生生長因子-BB等，而這些因子均與骨骼和傷口愈合有關，由此認為，殼聚糖/纖維蛋白原共聚物可調節巨噬細胞對骨重塑及骨再生的反應。同時，纖維蛋白還是創面愈合的重要基本成分，具有較強的血管再生性能，是骨再生的重要組成部分[12-13]。Cuadros等[14]制備了海藻酸鈣/明膠多孔支架，該支架除了可改善間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的黏附和增殖，還可影響MSC分化為成骨細胞和成軟骨細胞譜系的過程。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，具有良好的生物相容性，可用于骨和軟骨支架，而天然聚合物的不足之處在于其可導致嚴重的免疫排斥反應或自身攜帶微生物、病毒等造成感染風險，同時其穩定性較低還會導致降解和分解代謝率較高[15]。

2.2合成聚合物 合成聚合物主要包括聚酯類(如聚乳酸、聚乙醇酸、PCL)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic acid-glycolic acid，PLGA)等。合成聚合物合成簡單、成本低，且制造工藝可由實驗室制造擴大至工業規模以滿足潛在臨床需求，同時部分商業化合成聚合物的物理、化學和機械性能也與天然組織相似[16]。聚乳酸除了具備良好的力學性能和熱穩定性外，還具有生物相容性[10]。Teixeira等[17]制作了涂有Ⅰ型膠原蛋白和聚多巴胺的聚乳酸支架，并研究豬骨髓干細胞對其的反應，結果發現聚多巴胺+Ⅰ型膠原蛋白在前14 d可促進豬骨髓干細胞細胞外基質沉積，在21 d時，豬骨髓干細胞中的堿性磷酸酶表達水平顯著升高，表明聚多巴胺和Ⅰ型膠原蛋白涂層可增強3D打印的聚乳酸支架的骨誘導性。合成聚合物的缺陷主要在于合成聚合物均是疏水的，可導致生物活性降低[18]。Shafiee等[19]選擇聚乙烯醇和PCL制作支架用于兔模型體內研究，結果發現模型兔的病灶缺損愈合良好。

2.3金屬材料 鈦合金、鈷基合金、鎂合金等金屬材料作為優秀候選材料的主要特性是對活細胞良好的生物相容性，這在很大程度上決定了植入物能否成功與骨宿主相結合[20-21]。與其他金屬植入物相比，多孔鎂和鎂合金的機械性能更接近天然骨[22]。此外，Lino等[23]研究發現，鍶的二價陽離子可替代HA中的鈣，在骨骼形成過程中起誘導合成代謝和抗分解代謝的作用；該研究中制作的含1%鍶的PCL-富馬酸二異丙酯支架可促進骨組織再生，且未引起局部炎癥反應，同時血清鍶水平未升高還可避免引發心血管反應。Rentsch等[24]將三價鉻摻入透鈣磷石形成的磷酸鈣骨水泥并植入大鼠的骨缺損，結果發現新骨組織的形成顯著增加，并可以濃度依賴的方式顯著改善骨吸收和新骨形成，表明加入三價鉻是一種增強磷酸鈣骨水泥細胞相容性的創新方法。金屬材料的缺點在于其不能隨著時間的推移而腐蝕，且釋放的金屬離子可導致感染及其他健康問題等[25]。

2.4無機材料 磷酸鈣、陶瓷、生物活性玻璃或其組合是目前最常用的合成骨替代物，該類骨替代物具有合適的剛度、優異的骨傳導性和骨誘導性以及耐化學腐蝕特性，可促進生物礦化[26]。如Oliveira等[27]將高互通性大孔HA支架接種于大鼠骨髓基質細胞，結果顯示細胞黏附與增殖情況均較好，且具有一定活力。此外，多種無機材料也可組合成復合無機材料，如HA/TCP。而生物材料另一重點研究領域是β-TCP，常見的組合方式是不同比例的較穩定部分HA與易溶部分β-TCP組合，其中HA具有良好的機械性能，β-TCP除了具有骨傳導性，還有骨誘導性及安全性，這種組合可提高材料本身的生物活性和生物降解率，在保證生物材料穩定性的同時促進骨生長。研究發現，與其他比例(76/24、63/37、56/44)HA/β-TCP、純HA和純β-TCP支架相比，種植人MSC的HA/β-TCP(20/80)支架具有最高的成骨速率[28]。但目前只有HA/β-TCP(65/35)、HA/β-TCP(60/40)和HA/β-TCP(50/50)在人體臨床試驗中成功應用[29]。此外，無機材料還可與有機聚合物組成復合材料，如PLGA/TCP、PCL/TCP和PLGA/HA等。有研究通過低溫3D打印技術，以PLGA/TCP復合材料為載體，將多種骨誘導活性分子(淫羊藿素、淫羊藿苷、丹酚酸B、金屬鎂等)融入PLGA/TCP生物墨水，構建促進骨再生多孔材料，結果顯示PLGA/TCP可作為低溫3D打印的理想生物墨水，用于負載多種骨誘導活性分子，促進骨缺損再生[30-33]。目前的3D打印技術已經開發出具有復雜內部結構的HA支架，細胞可擴散至支架深層而不會發生堵塞。因此，HA是適用于骨重建的有前途的生物材料。近年，生物活性玻璃的研究重心已轉移至介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glass，MBG)。結合3D技術，使用聚乙烯醇作為黏合劑制作的多功能MBG的機械強度較傳統MBG顯著升高[34]。Wu等[35]將MBG/絲綢支架植入小鼠的顱蓋缺損中，結果發現，與純絲綢支架和非MBG/絲綢支架相比，MBG/絲綢支架Ⅰ型膠原蛋白的表達和新骨形成均顯著增加。但MBG脆弱易碎、機械強度低，限制了其在骨組織工程學中的應用。將MBG與生物聚合物(如PCL)結合可提高機械強度。Yun等[36]提出，可在MBG/PCL支架上進行細胞外基質組分預涂，使其具有足夠的機械性能和良好的3D互聯孔結構。

3 用于骨組織工程的生物活性因子或細胞

3.1生長因子在組織工程中的應用 在組織工程學中，可將生長因子與可生物降解載體結合，載體可提供一定的機械強度，而生長因子的持續緩釋可增加其在生物體內的濃度，刺激細胞的黏附、增殖和分化，促進骨和軟骨的再生，同時還可避免全身性使用的不可預測后果，如缺乏長期穩定性、劑量依賴性所導致的致癌性等。有研究提出，可將復合支架與成骨細胞、生長因子或骨形成蛋白結合形成新的傳遞載體[37]。BMP作為重要的內源性骨誘導因子之一可誘導成骨反應和骨形成，其中BMP-2和BMP-7是骨髓MSC(bone marrow MSC，BMSC)骨分化過程中的有效刺激因子[38]。Wang等[39]制作了結合基因工程的3D打印雙功能支架，實現了在多西環素介導下釋放BMP-2；進一步研究顯示，多西環素介導釋放的BMP-2可導致成骨細胞分化能力、誘導骨組織形成能力均顯著增強；同時，多西環素還具有廣譜抗菌能力，可防止感染的發生，并可修復感染性骨缺損。此外，轉化生長因子、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纖維細胞生長因子等特定信號分子也可促進組織生長。Chen等[40]研究發現，衰老可損害BMSC對IGF-1的促有絲分裂活性和成骨潛能，研究者將過表達IGF-1的衰老BMSC接種到海藻酸鈣支架，結果發現衰老的BMSC中的IGF-1過表達可促進支架中的細胞簇形成，導致細胞簇內部的細胞存活率增加，從而誘導成骨細胞標志物的表達，增強細胞簇的生物礦化作用，表明IGF-1過表達可增強細胞的成骨能力。Lee等[41]將聚多巴胺和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)直接移植到支架表面以誘導有效血管生成過程，結果發現，對血管生成十分重要的CD31的表達增加，原因在于VEGF與VEGF受體2結合可增加VEGF受體2的信號轉導，導致VEGF的血管生成活性增強。BMP-2、VEGF和堿性成纖維細胞生長因子之間的組合還會對人臍靜脈內皮細胞血管生成過程產生協同促進作用，在血管活化初期階段添加成纖維細胞生長因子-2與VEGF、在血管成熟階段添加BMP-2，均可產生更強的體內外血管生成反應[42]。

3.2細胞在組織工程中的應用 由于骨骼與軟骨組織具有獨特的組織生長機制、物質代謝和不同成分，目前開發的骨-軟骨雙層復合支架即是利用不同材料之間的優點促進骨軟骨細胞的生成。骨-軟骨雙層支架不是在單一結構中恢復骨和軟骨的功能，而是模仿不同組織的天然細胞外基質。有研究者提出，可將成骨細胞與軟骨細胞共培養，然后再移植到支架中以模擬功能化的軟骨-骨界面，從而促進成骨細胞與軟骨細胞的生長和分化[43]。Wu等[44]制作了軟骨細胞/成骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架和軟骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架，并用于小獵犬關節軟骨缺損的治療，結果顯示，軟骨細胞/成骨細胞負載的β-TCP生物陶瓷支架的股骨滑車相對軟骨再生能力>軟骨細胞復合β-TCP生物陶瓷支架>β-TCP生物陶瓷復合支架。目前，雙層支架主要包括3種類型：①單一不均勻支架，將軟骨組織或軟骨細胞直接種植于骨支架基底上的新骨組織；②組合式雙層支架，將兩種不同的軟骨支架和骨支架連接組裝在一起；③一體化雙層支架，將兩個不同部分組成的雙層支架通過共有的共同材料融合在一起[45]。MSC也是骨組織工程學中的良好應用材料，其具有分化為多種不同結締組織(如軟骨、骨骼、肌肉和肌腱組織)的能力[46]。BMSC作為多能干細胞可分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，因此可應用BMSC提高關節炎中軟骨缺陷的內在修復潛能[47]。

4 復合支架的孔徑設計

天然骨組織是孔隙率為50%～90%、孔徑為1 mm的多孔環境[48]。相關研究證明，支架的孔結構是細胞分化、增殖以及新組織再生的重要因素[49-51]。孔間連接是重要參數，其可在沒有血液供應的情況下，幫助運輸氧氣、營養物質和代謝廢物，同時還可作為血管的形成途徑，為了獲得良好的孔間流動性，建議孔間連接應為15～50 μm[52]。同時，骨組織工程支架的孔徑率和孔徑大小也會影響細胞的生長發育、附著以及生物降解和藥物釋放速率，因為孔徑率和孔徑大小可決定支架的表面積[53]。孔徑減小可增加支架的表面積，從而促進細胞的相互結合以及細胞與支架表面的相互作用。若孔徑太小，細胞可能難以遷移至支架結構中，因此支架的孔徑大小應有利于細胞反應過程。骨形成中，細胞生長的孔徑為100～150 μm，而血管形成中則要求孔徑>300 μm[54-55]。目前，骨組織工程中開發的主要支架見表1。

表1 骨組織工程中開發的支架

5 小 結

骨缺損的修復過程復雜且困難，因此作為替代傳統骨重建方法的骨組織工程學中的骨修復材料的選擇十分重要。骨組織工程學復合支架的物理和化學特性、支架的設計方案以及材料之間的相互作用均可影響細胞誘導分化的作用。因此，未來還需要進一步在動物模型中進行體內研究，根據骨缺損修復的情況研究支架的整合能力、骨骼中的血管形成、可能出現的炎癥反應以及在生物體內的長期穩定性，并更好地將實驗室數據轉化為臨床相關策略，為骨缺損的修復提供新思路。