不同冷凍保護劑在血管深低溫保存中的研究進展

譚麗，王成，陳世玖

(遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院整形手外科,廣東 珠海 519100)

血管參與構成人體循環系統，作為眾多組織、器官運輸能量的載體，起到再植后向組織、器官供送血液的作用，血管超低溫保存技術可增加器官、斷肢、斷指移植機會。在實驗和臨床工作的基礎上，2011—2013年首次驗證了深低溫保存的動靜脈移植物用于臨床[1]。人體血管超低溫保存技術是旁路手術或外周血管重建的重要工具，因此需儲備大量血管供臨床所需[2]。最初研究冷凍保存的方法主要為細胞深低溫保存技術，對于同種細胞類型，存在一組最佳保存的條件；而組織是復雜的多細胞系統，其含有不同類型的細胞，具有不同的超低溫保存要求。在冷凍保存過程中，組織內的所有細胞類型將受到相同的冷卻和解凍參數，并且組織的結構及功能更為復雜，故確保血管結構的完整和功能的保留是決定超低溫保存成功的關鍵[3]。理想的超低溫保存血管應保持與新鮮血管相當的功能特性，超低溫保存技術是最常見的保存方法，在超低溫保存中會引起細胞凋亡及組織結構損害，為了改善冷凍和解凍過程中的細胞損傷，冷凍保護劑(cryoprotectant，CPA)在超低溫保存中被應用[4]。但常見CPA具有一定的毒性作用，阻礙超低溫保存同種異體血管的臨床發展[5]。現通過血管超低溫保存的損傷機制、CPA在血管超低溫保存中的應用及對血管超低溫保存技術的展望總結當前血管超低溫保存技術的現況，為后續制訂更標準的血管及器官超低溫保存方案提供一定的理論依據。

1 血管超低溫保存的損傷機制

19世紀和20世紀早期，生物學家對冬季耐寒和冰霜抵抗研究后產生了一些最早的冷凍保存概念，在沒有添加任何CPA的生物樣品中，凍結的細胞和組織發生了深低溫保存誘發的損傷，例如細胞內冰晶形成和巨大滲透差。血管由內膜層、中膜層、外膜層組成，三層膜分界不清，內膜層由血管內皮細胞組成，向外延續至肌層，中膜層由平滑肌細胞及纖維細胞構成，向外延續至漿膜層。血管是由多種細胞及纖維組織、基膜構成的環狀結構，超低溫保存均會造成這兩種結構的損傷。

1.1血管細胞損傷 構成血管組織的細胞包括內皮細胞、平滑肌細胞、纖維細胞等，在超低溫保存過程中隨著冷卻的進行，細胞在超低溫保存液中失去滲透平衡。從常溫至-196 ℃，細胞及細胞外基質發生一系列變化；在冷卻溫度 -5 ℃時，細胞外基質開始冷凍，但細胞質仍未凍結；在-5～-10 ℃，細胞外冰晶形成增多導致基質中溶質濃度增加，造成嚴重細胞脫水和收縮；在-10～-15 ℃，細胞外冰晶形成進一步增多，細胞與冰和細胞與細胞接觸增加，導致細胞損傷。事實上，在-15～-60 ℃，細胞內液完成水到冰的過渡，細胞內凍結增多；細胞外冰晶生長較大，冰晶氫鍵通過細胞膜實現細胞內凍結，以此來均衡細胞內外滲透壓。細胞內凍結被認為是冷凍保存誘導的細胞損傷的主要因素[6]。因此，在-15～-60 ℃，必須實現兩次冷凍、解凍，這是細胞成活的重大挑戰[7]。

1.2血管細胞外成分損傷 血管組織除了由各類細胞構成外還有纖維組織、基膜等。血管屬圓筒狀結構，在超低溫保存過程中體積膨脹和組織內溫度分布不均引起生物樣品內部溫度分布不均，溫差較大，在組織內部產生較大的熱應力，尤其是在凍結過程中由于體積膨脹引起的熱應力，使超低溫保存的組織遭受機械損傷。1994年Hunt等[8]發現血管超低溫保存中組織的斷裂，徐紅艷等[9]發現，低溫保存血管組織時,管壁上出現裂紋甚至發生斷裂，并提出其與降溫速率有關。采用階梯式慢速復溫可以減少血管超低溫保存中的機械應力損傷。此外，在超低溫保存中加入CPA使得血管凍結過程未凍結水分額明顯增大，避免了熱應力對血管的機械損傷。胥義等[10]的實驗亦證明，降溫速率和低溫保護劑濃度會對血管熱應力產生影響。添加高濃度的CPA時，血管超低溫保存中的熱應力顯著減小。

2 CPA在血管超低溫保存中的應用

為避免超低溫保存中細胞內外冰晶形成及凍結后的機械應力損傷，研究人員開始向超低溫保存液中添加化學品，它們被稱為“CPA”，并進行了CPA的初步嘗試。CPA是一種廣泛的術語，可以用于描述任何外部添加劑，當在冷凍之前添加時，可保護細胞免受各種超低溫保存損傷并保留細胞活力。根據能否通過細胞膜將CPA分為滲透性和非滲透性，常見的滲透性CPA有二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油、甲酰胺和丙二醇等；非滲透性CPA有糖類(如蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖和D-甘露醇)和高分子聚合物類[如聚乙二醇和羥乙基淀粉(hetastarch,HES)]。它們的冷凍保護作用包括降低溶質的濃度以及在脫水和復溫階段增加膜穩定性[11]。在超低溫保存中使用低濃度CPA以保護血管同種異體移植物為經典的超低溫保存方式——超低溫慢速冷凍技術；雖然低濃度CPA可以減少冰晶的形成，但不能形成玻璃化狀態。然而，玻璃化形成需要較高濃度的CPA，常用的CPA(如DSMO)具有一定的毒性，故冷凍保護溶液的毒性去除需要更多的研究，為超低溫保存組織庫制訂更為標準的玻璃化保存方案[12]。

2.1滲透性CPA的應用 1949年，由于錯誤標記凍結了甘油、雞蛋液及水，發現甘油具有冷凍保護的作用[13]；隨后其被廣泛應用于細胞與組織超低溫保存。早在1976年，Ramazzotto和Engstrom[14]將灌注5%、10%及15%甘油哺乳動物心臟放入液氮中進行超低溫保存，并且用組織學、組織化學和電子顯微鏡技術檢查心室組織的組織學損傷、糖原耗竭和酶位點，發現甘油在心臟深低溫保存中具有保護作用。有報道顯示，使用血管吻合術移植超低溫保存的大鼠卵巢中可產生正常卵子，并發現在冷凍大鼠卵巢中有一部分血管功能保存良好[15]。甘油由于具有脂溶性可進入細胞內，調節細胞內外滲透壓，從而減輕血管在超低溫保存中的損傷。

甘油的運用雖廣泛，但不能溶于水，不能用作保存所有細胞類型的通用溶質。為了克服這一問題，Lovelock[16]開始探索其他低分子量的化合物，發現DMSO對活細胞的滲透性比甘油更高，觀察到DMSO滲透細胞(牛和人紅細胞)的速度比甘油更快，且需要量低，凍結損傷小。1987年，O′Brien等[17]引入了使用DMSO作為CPA的心血管組織的長期儲存的冷凍保存，并證實了DMSO對主動脈的保護效果，新鮮與冷凍保存的同種異體移植物的活力相近。Westphal等[18]用DMSO灌注和浸泡動物卵巢進行超低溫保存，發現低溫保護水平可達90%～100%，當使用相同的方法超低溫保存人類卵巢時，在組織水平上觀察到其保護作用超過95%；此外，血管內皮沒有明顯的形態學損傷。

2.1.1滲透性CPA的毒性 2018年，Finger和Bischof[19]提出玻璃化保存是器官超低溫保存的一個新技術，可以替代常規超低溫保存。玻璃化保存是通過調節CPA濃度和冷卻速率，使液體物質快速冷卻的過程，其過程基本上可以預防細胞內外冰晶形成，將冷卻的液體轉化為玻璃化狀態，更好地保存細胞外基質和細胞活力。玻璃化保存技術需高濃度的CPA，故CPA的毒性作用被關注。作為最廣泛使用的CPA，DMSO本身具有的劣勢限制了其臨床應用。首先，DMSO是具有內在毒性的有機溶劑。據報道，DMSO與細胞代謝和發育的功能障礙有關，引起酶的功能受損和細胞凋亡[20]；此外，DMSO可強烈促進干細胞不受控制的分化[21]。在臨床細胞移植中，DMSO被認為是引起患者各種不良反應的原因，包括免疫、神經系統并發癥和腎肝功能的影響等[22]。其次，為了使DMSO引起的不利影響最小化，需要較長時間的洗滌步驟，因為DMSO的跨膜擴散速率明顯低于水通道蛋白的運輸速率，在DMSO去除期間，巨大滲透壓差也會導致細胞損傷。故如何降低超低溫保存中CPA的毒性有待進一步研究。

2.1.2低毒滲透性CPA DMSO具有一定毒性作用，難以應用于臨床，因此需要更為標準的CPA來替代DMSO，天然生物相容性滲透性CPA同樣可以通過降低滲透壓來保護細胞，防止細胞免受滲透損傷的影響，而不會影響重要的細胞功能。此外，大多數滲透劑是親水分子，脯氨酸、甘氨酸和牛磺酸是3種類型生物相容性滲透性CPA的代表[23]，天然存在于哺乳動物的組織、肌肉和心臟中。Yang 等[24]探討了3種生物相容性滲透性CPA的作用，發現脯氨酸預防哺乳動物細胞滲透損傷及抑制細胞內外冰晶形成的能力較強。為尋找高效和生物相容性的CPA提供了一種新途徑。

2.2非滲透性CPA的應用 一些糖類(蔗糖，海藻糖和棉籽糖)以及高分子聚合物類(HES)已用于哺乳動物組織的玻璃化保存[25]。糖類在超低溫保存中的作用為：①增加玻璃化溶液的黏度，并提高玻璃化溶液所需的玻璃化轉變溫度，減少細胞外冰晶形成導致的細胞物理損傷[26]；②在冷凍期間通過氫鍵穩定細胞膜，從而保護細胞[27]；③在冷卻過程中，糖類保護組織和細胞免受降溫和CPA去除期間的滲透沖擊引起的損傷；在變暖期間，細胞外CPA濃度迅速降低，導致滲透性不均衡引起細胞過度膨脹，最終導致細胞裂解[28]；④輔助滲透CPA形成玻璃化，糖類有助于增加玻璃化溶質的黏度和張力，允許使用較低濃度的滲透CPA，從而降低滲透性CPA的細胞毒性和滲透休克效應[28]；⑤糖類還可以幫助滲透性CPA提高細胞外溶液的玻璃化狀態，大大減少細胞外冰晶的形成。

2.2.1糖類 非滲透性CPA通過在低溫下保留更多的液態水來穩定細胞體積，從而降低外部電解質濃度，減少滲透損傷，如單糖和二糖均廣泛用于細胞系的低溫保存。但與單糖相比，蔗糖和海藻糖是所有二糖中最有效的CPA。在血管超低溫保存中，糖類常作為輔助保護劑與滲透性CPA一起發揮保護作用。1992年，Müller-Schweinitzer 和Ellis[29]將蔗糖和DMSO一起用于超低溫保存血管并探索其功能活性，證實了滲透和非滲透性的保護作用是協同的，即通過DMSO和蔗糖的組合作用，可實現對冷凍血管平滑肌的保護。在糖類中，因為蔗糖成本低，所以主要用于哺乳動物組織的玻璃化。Arutyunyan等[30]的研究發現，最終濃度為0.2 mol/L蔗糖會提高甘油的效率；10%甘油和蔗糖的組合保存效果與DMSO和乙二醇與蔗糖的組合相當，故蔗糖對脂膜的動態特性會促進甘油進入細胞。滲透性和非滲透性CPA均直接在細胞膜水平上發揮作用，所以它們的保護行為是協同作用。

此外，研究表明中藥及復方可以改善血管內皮細胞氧化應激損傷，一些中藥提取物值得被關注，如枸杞多糖、附子多糖等；這些中藥提取物作為非滲透性CPA具有低毒性的特點，顏貝等[31]將枸杞多糖應用于精子的超低溫保存保護，發現其可降低精子活性氧水平，保護線粒體結構和功能，從而改善解凍后精子質量。附子多糖是我國中藥附子中的提取物，其可以抑制血管鈣化、延緩心肌衰老及保護心肌細胞等。研究發現，附子多糖具有抗氧化應激、保護平滑肌細胞及內皮細胞的功能，從而保護血管[32]，由此可將附子多糖引入血管的深低溫保護研究中，但目前尚缺乏整體且系統的實驗研究。

2.2.2高分子聚合物類 一些高分子聚合物也被用于血管冷凍保護，如HES，K?rber和Scheiwe[33]的研究表明,HES通過從細胞膜外部吸收水分子并將它們保持在玻璃化狀態下，而不會在冷卻期間降低超低溫保存液的黏度，引發脫水速率的增加(避免細胞內冰晶形成以及冷卻損傷)，動力學抑制冰晶形成。迄今為止，HES已成功用于冷凍保存許多生物材料，包括胰島、肉芽細胞、倉鼠細胞和其他一些細胞類型[34]。非滲透性CPA具有低毒性的特點，但單獨使用保護效果欠佳，聯合使用滲透性和非滲透性CPA可以減輕毒性，同時實現更強的血管內皮細胞保護作用。Sultani等[35]通過將DMSO與HES聯用改善了超低溫保存后人臍靜脈內皮細胞的活力。

2.3新型CPA——間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC) 除多種CPA聯合應用外，MSC在組織再生中發揮重要作用并被廣泛研究[36]，如傷口修復、維持組織穩態和促血管化。在適當的條件下，MSC可以被激活，獲得內皮表型，分化為周細胞或內皮細胞，并摻入血管壁中，該血管壁支持新血管形成和穩定原有血管。此外，MSC能夠分泌各種血管生成因子，例如血管內皮生長因子、血管生成素、成纖維細胞生長因子和白細胞介素-6，誘導血管內皮細胞募集以建立血管形成的微環境[37]，這些因素均有利于血管生成。Xia等[38]在小鼠卵巢超低溫保存中加入MSC發現，其可以促進卵巢血管的生成。MSC可作為新型CPA與滲透性和非滲透性CPA一起發揮保護作用，這一研究為探索CPA的種類提供了新思路。

3 小 結

玻璃化保存是血管超低溫保存的首選技術，為使超低溫保存液達到玻璃化狀態需要添加高濃度的CPA。常見CPA中的DMSO具有較大的毒性作用，故低毒性的CPA(如多糖類)及無毒性的CPA為研究熱點。針對不同的部位及種類血管組織，如何選擇合適的CPA并靶向制訂超低溫保存方案，既確保血管超低溫保存后具有生物活性，降低免疫原性，又能抑制血栓形成，有待進一步研究。期待在未來，通過技術的革新，對血管及其他器官制訂出一套完整的靶向超低溫保存方案，并成立“血管銀行”甚至“器官銀行”，為臨床應用及科研發展提供更多的便利。