黔產玄參的“發汗”方法研究

鄧 瑩 劉 杰 魏學軍 夏 朵 馬江蠶

黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000

玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功能，臨床常用于治療熱病熱入營血、溫毒發斑、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽、目赤、咽痛、白喉、瘰疬與癰腫瘡毒等癥候，主產浙江、貴州、四川與河北等省區[1]。

發汗作為中藥材產地加工的一種特殊方法，是影響中藥材質量的重要因素之一，它可使藥材變色、變軟、增加香味或減少刺激性，其加工方法為將藥材用微火烘或曬至半干或微蒸(煮)后堆置起來，使其內部發熱而析出水分[2]。玄參的發汗方法在2020版《中華人民共和國藥典》中規定為“冬季莖葉枯萎時采挖，除去根莖、幼芽、須根及泥沙，烘或曬至半干后堆放3～6 d，反復操作，直至干燥”[1]。但由于地域的差異性，目前在玄參的產地加工方法中，除了按照《中華人民共和國藥典》規定的“發汗”方法加工之外，不同產地所采用的“發汗”方法各不相同[3]，已報道的文獻中玄參“發汗”的質控指標僅局限于核苷類成分[4]，而玄參的主要化學成分有環烯醚萜類、苯丙素苷類、有機酸類等化學成分[5]，其中哈巴苷、哈巴俄苷具有抗炎作用[6-7]，肉桂酸具有瀉下、抗細菌和真菌作用[8]，是玄參的主要生物活性成分。因此，本研究擬以哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸三種指標性成分的含量作為考察指標，比較“藥典發汗”曬干品和烘干品、“蒸后發汗”曬干品和烘干品、“煮后發汗”曬干品和烘干品玄參中上述指標性成分含量，以綜合評分法優選黔產玄參的“發汗”方法，以期為黔產玄參產地加工方法的建立提供實驗性理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 試驗用新鮮玄參購于貴州省遵義市道真縣玄參種植基地，經黔南民族醫學高等專科學校中藥教研室李香教授鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的根。哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸對照品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司(批號：CHB-H-006，CHB190105，CHB190106)，乙腈(色譜純)，水為娃哈哈純凈水，余試劑均為分析純。

1.2 儀器 高效液相色譜儀Agilent1260型(美國Agilent公司)；SG-4050C型數顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；AE240型電子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 型超聲波清洗機(杭州匯爾公司)；DHG-9240A型真空干燥箱(上海金山公司)。

2 方法與結果

2.1 樣本的確定試驗 藥材經高效液相色譜法測定玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的總量符合2020版《中國藥典》規定(不少于0.45%)。

2.2 樣品的制備

2.2.1 藥典“發汗”曬干品(A1)[1]按《藥典》記載方法操作。將新鮮玄參洗凈后，曬至半干，于陰涼通風處堆放 3 d，取出，曬 1 d 后再堆放，反復發汗6次即可干燥。

2.2.2 藥典“發汗”烘干品(A2)[1]按《藥典》記載方法操作。將新鮮玄參洗凈后，于 60 ℃ 烘至半干，于陰涼通風處堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反復發汗3次即可干燥。

2.2.3 蒸后“發汗”曬干品(A3) 將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計)后，取出，曬至半干，余步驟同“2.2.1”項。

2.2.4 蒸后“發汗”烘干品(A4) 將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計)后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，余步驟同“2.2.2”項。

2.2.5 煮后“發汗”曬干品(A5) 將新鮮玄參洗凈后，于沸水中煮 30 min 后，撈出，曬至半干，余步驟同“2.2.1”項。

2.2.6 煮后“發汗”烘干品(A6) 將新鮮玄參洗凈后，于沸水中煮 30 min 后，撈出，于 60 ℃ 烘至半干，余步驟同“2.2.2”項。

2.3 哈巴苷、哈巴俄苷的測定方法[1]

2.3.1 色譜條件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.03%磷酸水(B)，流動相梯度條件見表1。流速 1.0 mL/min；進樣量 10 μL；柱溫 20 ℃；檢測波長 210 nm。對照品溶液、供試品溶液HPLC色譜圖如圖1所示。

表1 流動相梯度條件

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號篩)各 0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇 50 mL，密塞稱重，浸泡 1 h，超聲提取(功率 500 W，頻率 40 KHZ)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取哈巴苷對照品 6.05 mg、哈巴俄苷對照品 2.32 mg，置于 100 mL 量瓶中，加30%甲醇稀釋成含哈巴苷 60.50 μg/mL、哈巴俄苷 23.20 μg/mL 的混合對照品溶液，冷藏備用。

2.4 肉桂酸的測定方法

2.4.1 色譜條件 880975-902C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸水(40∶60)；流速 1.0 mL/min；進樣量 10 μL；柱溫 25 ℃；檢測波長 285 nm。對照品溶液、供試品溶液HPLC色譜圖如圖2所示。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號篩)各 1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇 20 mL，密塞稱重，浸泡 1 h，超聲提取(功率 500 W，頻率 40 KHZ)30 min，提取3次，合并濾液定容至 100 mL，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4.3 對照品溶液的制備 精密稱取肉桂酸對照品 1.0 mg，置于 100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋成含肉桂酸 10 μg/mL 的對照品溶液，冷藏備用。

2.5 線性關系考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合對照品溶液、肉桂酸對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，按照“2.3.1”項下哈巴苷、哈巴俄苷和“2.4.1”項下肉桂酸色譜條件進樣，以進樣量(μg/mL)為橫坐標X、峰面積Y為縱坐標進行回歸。結果見表2。

表2 線性關系考察結果

2.6 方法學考察 精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷混合對照品溶液、肉桂酸對照品溶液各 10 μL，按“2.3.1”項下哈巴苷、哈巴俄苷色譜條件和“2.4.1”項下肉桂酸色譜條件連續進樣6次，結果哈巴苷峰面積RSD=0.76%，哈巴俄苷峰面積RSD=0.63%，肉桂酸峰面積RSD=1.3%，表明儀器精密度良好。取A1樣品粉末(過三號篩)，6份，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備哈巴苷、哈巴俄苷供試品溶液，按“2.4.2”項下方法制備肉桂酸供試品溶液，分別依色譜條件測定并計算哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量，結果哈巴苷含量RSD=1.18%，哈巴俄苷含量RSD=1.78%，肉桂酸含量RSD=1.82%，表明該方法重復性良好。精密吸取哈巴苷和哈巴俄苷對照品溶液、肉桂酸對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按相應色譜條件進行測定，結果哈巴苷含量RSD=1.14%，哈巴俄苷含量RSD=1.88%，肉桂酸含量RSD=0.81%，表明哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸對照品在 24 h 內保持穩定。取 0.25 g 哈巴苷含量為 0.53 mg、哈巴俄苷含量為 0.73 mg 的A1樣品6份，精密稱定，按表3精密加入適量哈巴苷、哈巴俄苷對照品，按“2.3.2”項下方法制備哈巴苷和哈巴俄苷供試品溶液，在“2.3.1”項下色譜條件測定并計算加樣回收率；另取 0.5 g 肉桂酸含量為 0.46 mg 的A1樣品，6份，精密稱定，按表3精密加入適量肉桂酸對照品，按“2.4.2”項下方法制備肉桂酸供試品溶液，在“2.4.1”項下色譜條件下測定并計算加樣回收率。試驗結果見表3。

表3 加樣回收率測定結果 (n=6)

2.8 樣品含量測定 精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號篩)各 0.5 g，按“2.3.2”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定并計算哈巴苷和哈巴俄苷含量，結果見表4。精密稱取A1～A6玄參樣品粉末(過三號篩)各 1.0 g，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定并計算肉桂酸含量。結果見表4。

表4結果顯示，不同“發汗”加工方法對玄參中三種指標性成分的含量均有影響。從《藥典》記載的定量指標哈巴苷和哈巴俄苷的總量來評價，各種“發汗”方法的制品均符合《藥典》規定的含量要求。

表4 不同“發汗”加工方法哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量測定結果 (n=3)

2.9 綜合評分法 優選玄參的“發汗”方法根據參考文獻[9]，采用綜合評分法優選玄參“發汗”方法。在數據處理時引用指標隸屬度，即指標隸屬度=(指標最大值-指標值) /(指標最大值-指標最小值) 。根據各指標在玄參中的重要性，考慮以哈巴苷占35%、哈巴俄苷占35%、肉桂酸占30%的權重，實驗綜合評分=哈巴苷占隸屬度×35%+哈巴俄苷隸屬度×35%+肉桂酸隸屬度×30%，總分為1.00分。評分結果以綜合分數作為總指標進行直觀分析。結果見表5。

表5 綜合評分

從表5的綜合評分來看，得分最高的是A4樣品，即蒸后發汗烘干品。因此，通過綜合評分篩選出的玄參最佳發汗方法為：將新鮮玄參洗凈后，于籠屜內隔水蒸 30 min(按“圓氣”后計)后，取出，于 60 ℃ 烘至半干，于陰涼通風處堆放 3 d，取出，60 ℃ 烘 30 min 后再堆放，反復發汗3次。

3 討論

藥材在干燥過程中，含黏液質、淀粉或糖較多的藥材不易干燥，經蒸、煮或燙處理后，則易干燥，而玄參氣味有明顯的焦糖氣[2]，且已有文獻資料[10]顯示玄參中多糖含量達13.83%。因此，實驗中樣品制備方法的選擇在2020版《中國藥典》規定的玄參產地加工方法的基礎上，參考文獻[11-14]增加了“蒸后發汗”曬干品和烘干品、“煮后發汗”曬干品和烘干品。從發汗的時間來看，“蒸后發汗”和“煮后發汗”大大縮短了后續的曬或烘的時間。從哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸含量的綜合評分來看，“蒸后發汗”品的綜合評分明顯高于“藥典發汗”品和“煮后發汗”品，其中“蒸后發汗”烘干品的綜合評分最高(0.9695)，但“煮后發汗”品綜合評分相對較低，分析原因可能是新鮮玄參在煮的過程中與水接觸導致哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸溶出。此外，每一種“發汗”烘干品的綜合評分都高于曬干品，推測其原因可能是烘干品干燥的時間較短，減少了玄參中哈巴苷、哈巴俄苷和肉桂酸三種有效成分的氧化或水解[15]。

黔產玄參的采收時間為10～11月，而此時貴州天氣陰冷潮濕，平均溫度為9～15 ℃，預實驗在 15 ℃、20 ℃、25 ℃ 溫度下考察“發汗”溫度時，發現 20 ℃ 以上溫度“發汗”都會使玄參發霉變質，因此本試驗中所有樣品“發汗”的溫度均為 20 ℃ 以下的貴州常溫，且樣品干燥方法采用曬干法時，由于空氣中水分含量較高，曬干的時間較長，增加了時間成本。因此，結合貴州的氣候特點，建議黔產玄參“發汗”過程中干燥時采用烘干法，發汗樣品的處理采用“蒸后發汗”法，該方法可為黔產玄參產地加工方法的建立提供參考。對于黔產玄參的發汗機制和藥理作用還需進一步深入研究。