清肺解毒丸的提取工藝研究

康紹建 王 飄 朱志坤 郭媛媛 陳凌云*

1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省食品藥品審核查驗中心，云南 昆明 650011；3.云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，云南 昆明 650500

清肺解毒丸由金銀花、梔子、皂角刺等十七味中藥組成，該方具有清熱解毒、燥濕散結之功效。適用于肺胃濕熱所致的痤瘡、粉刺，癥見顏面、胸背部丘疹樣改變，或有膿皰、癢痛，伴有口渴、小便赤黃、便秘、舌紅苔黃膩等癥。方中君藥金銀花主要含有黃酮類化合物，具有抗炎和解熱之功效[1]；梔子含有環烯醚萜類、有機酸、黃酮、香豆素等成分，現代藥理研究[2]表明梔子具有抗炎、抗氧化、利膽、利尿、抗腫瘤、解熱、鎮痛等多種藥理活性；皂角刺中含有黃酮、酚類、三萜等成分[3]，常用于治療癰疽腫毒；白芷主要有效成分是香豆素類和揮發油，具有抗菌消炎、解熱鎮痛、止咳平喘等作用[4]；該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，處方中金銀花、烏梢蛇、蒼術等所含有效成分熱不穩定或水溶性差，難以煎出和保留，因此擬將其開發成濃縮丸，使患者服用、攜帶方便。本文就制備工藝中的提取工藝進行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Diamonsil C18色譜柱[迪馬科技(天津)有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm]；SK2200HP超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團)；T-1000型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)；真空干燥箱(蘇州江東 DZF-6020)。

1.2 試藥 梔子苷對照品(批號：110749-201919，純度97.6%)購至中國食品藥品檢定研究院。皂角刺、梔子等所用飲片均由昆明市中醫醫院提供，經四川千方中藥股份有限公司鑒定與檢驗合格。水為娃哈哈純凈水，色譜甲醇(德國Merck公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 因素水平的確定 實驗在預實驗以及查閱文獻的基礎上，選擇加水倍數(A)、提取時間(B)和提取次數(C)3個因素，各因素取3個水平，以L9(34)正交試驗表安排實驗，以干膏得率和梔子苷轉移率綜合評分為指標進行考察，并對其進行方差分析，考察各因素對實驗的影響程度大小，最終確定各參數的水平，篩選出最佳提取工藝條件[5]。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 干膏得率 稱取1/8倍處方量的飲片共 23 g，置于圓底燒瓶中，按表1正交試驗表進行回流提取，濾液轉移至 1000 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密移取 50 mL 至已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于 105 ℃ 干燥 3 h，取出，置干燥器中冷卻 0.5 h 后迅速稱定其質量，計算干膏得率(干膏得率=干浸膏量×20/生藥量)[6]。

2.3 梔子苷轉移率[7]

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈-水(8∶92)為流動相；檢測波長 238 nm；進樣體積 10 μL；流速 1 mL/min；柱溫 25 ℃；理論塔板數按梔子苷峰計算應不低于2000。

2.3.2 對照品溶液制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成質量濃度為 248.8 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 稱取1/8倍處方量的飲片共 23 g，進行回流提取，濾過，合并提取液，加蒸餾水定容至 1 000 mL，搖勻，精密移取 20 mL，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次 20 mL，合并正丁醇層，水浴揮至近干，殘渣加甲醇溶解，定容至 5 mL，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備 按照處方比例稱取除梔子以外的其余飲片，同供試品溶液制備方法制得缺梔子的陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，如圖1，結果表明專屬性良好。

2.3.6 線性與范圍 分別精密移取對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，至 10 mL 容量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列梯度濃度的溶液，按上述色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標，梔子苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程:Y=12.532X-11.536(r=0.9998)，結果表明梔子苷對照品含量在24.88～248.8 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.7 儀器精密度 取對照品溶液，重復進樣6次，結果梔子苷峰面積的RSD值為0.95%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復性 從同一份提取液中，取6份樣品，每份 20 mL，分別制成供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，計算梔子苷含量的RSD值為1.01%(n=6)，結果表明，該方法重復性良好。

2.3.9 穩定性 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，梔子苷峰面積的RSD值為1.58%(n=6)，結果表明，供試品溶液在 24 h 內穩定性良好。

2.3.10 準確度 精密量取已知含量的提取液(91.25 μg·mL-1)6份，每份 5 mL，分別加入 1.5 mL 已知濃度的梔子苷對照品溶液(248.8 μg·mL-1)，按供試品溶液制備方法進行制備，進樣，計算梔子苷含量和回收率。梔子苷的平均回收率為98.71%，RSD為2.53%，結果表明該方法準確度良好。

2.3.11 飲片含量測定 取梔子飲片3份，按《中國藥典》2020年版一部梔子“含量測定”項下方法分別進行測定，計算含量，結果得梔子苷平均含量為2.16%，符合藥典標準。

2.4 正交試驗安排與結果 按表1所設計因素水平表和表2正交表，依次進行提取，測定各試驗的干膏得率、梔子苷轉移率。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交實驗結果

表3 綜合評分方差分析

綜合評分[8]：梔子苷轉移率及干膏得率權重系數分別為70%和30%，以得出的綜合評分作為指標。綜合評分=(梔子苷轉移率/梔子苷最大轉移率×0.7+干膏得率/干膏得率最大值×0.3)×100。

根據表2正交試驗結果和表3綜合評分方差分析結果可知，加水倍數(A)和提取次數(C)對綜合評分的影響具有顯著性意義，3個因素影響從大到小排序為提取次數、加水倍數、提取時間，按綜合評分表中最高值優選出最佳提取工藝為A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h 。

2.5 工藝驗證 為保證工藝的合理可行，對優選出的提取工藝進行驗證。取處方量飲片3份，按A2B2C3條件提取，分別測定其干膏得率及梔子苷轉移率，驗證試驗結果見表4。結果顯示干膏得率和梔子苷轉移率平均值均接近正交試驗中最佳提取工藝結果，表明此方法具重現性，可作為最佳提取工藝條件。

表4 驗證試驗結果

3 討論

清熱解毒方由金銀花、梔子、皂角刺等十七味藥組成，該方原為湯劑，烏梢蛇打粉沖服，其余藥味以水煎煮。為使患者服用、攜帶方便，本研究擬開發其新劑型，若改為液體制劑或顆粒劑，烏梢蛇有效成分難以煎出，且烏梢蛇氣腥，煎煮難以掩蓋其氣味，若制成片劑或硬膠囊，因處方量較大，則每次服用片數或粒數過多，因此選擇將其開發為丸劑(濃縮丸)，水溶性差和熱不穩定成分可打粉入藥，含有水溶性成分的藥采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發揮藥效，濃縮丸表面打光還可掩蓋烏梢蛇的特殊氣味，便于服用。

經查閱文獻可知，本方中金銀花、烏梢蛇、白芷、浙貝母、蒼術、連翹中含有游離黃酮類、萜類、苯丙素類、香豆素類、生物堿類等難溶于水的成分[1-4,8-10]，因此以上六味采用打粉入藥。其余皂角刺、紫花地丁等適宜煎煮的飲片采用水提，能較好保留原料藥有效成分，更好發揮藥效。方中君藥皂角刺含有黃酮類、酚類、三萜類、香豆素類等成分[3]。在2020版中國藥典中，未記載其含量測定方法；紫花地丁主要有效成分是秦皮乙素，含量測定的相關文獻報道并不多；梔子的主要成分為梔子苷，是環烯醚萜苷類物質，易溶于水，受其他成分干擾小，易于測定，故選用梔子苷轉移率作為指標來考察提取工藝。

此次試驗利用HPLC法對梔子苷進行測定，從HPLC圖可看出，梔子苷的分離度高，無雜質峰干擾，專屬性強，該條件下測定結果的準確性、精密度、重復性較為良好，可作為其理想測定方法，為以梔子苷含量為指標的測定方法提供了參考依據。

正交試驗具有科學性高、步驟簡單、節省時間等優點，在中藥提取工藝優化設計中被廣泛應用[11]，本實驗采用多指標信息熵權重分析法，結合正交設計優化提取工藝，以加水倍數、提取時間、提取次數作為考察因素，以干膏得率和梔子苷轉移率為指標。根據試驗結果表明，提取次數對綜合評分影響最大，其次是加水倍數、提取時間。綜合干膏得率和梔子苷轉移率評價指標，得出其最佳提取工藝為煎煮3次，每次加10倍量水，煎煮 1.5 h。