不同時期布魯菌性脊柱炎患者T淋巴細胞亞群的變化研究

周麗紅 伍彥輝 趙輝 王曉靜 張向娥

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取石家莊市第五醫院2016年5月至2020年5月確診的BS患者120例為研究對象。其中急性期患者70例(58.33%)，慢性期患者50例(41.67%)。急性期70例中，男52例(74%)，女18例(26%)；年齡22～69歲，平均年齡(44.86±11.28)歲。患者都與牛、羊有過較為親密的接觸，有的患者雖未與活體動物有過親密接觸，但是接觸過未經處理的牛羊肉與皮毛，其中2例患者喝過未經消毒的羊奶。慢性期患者男36例(72%)，女14例(28%)；年齡16～66歲，平均年齡(42.48±16.45)歲。患者日常生活中都與牛羊等動物有不同程度的接觸。做為平行對照，納入性別、年齡相仿的健康人員30例。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 診斷標準：與我國在2012年新修訂的《布魯氏菌病診療指南》中的判斷標準相符：①有明確的流行病學史(有牛、羊接觸史或食入不熟牛羊肉制品或乳制品)；②在臨床治療中的反應，患者表現為渾身無力、發燒、背部感覺酸脹疼痛、骨關節感覺疼痛等。還有些患者會有一些神經癥狀出現，如頭痛等 ；③使用血清學檢查的方式進行判定，選用的補體結合試驗滴度和試劑凝集滴度的比值為1∶100++。選用抗人免疫蛋白實驗滴度時選用的數值需1∶400++。或者患者的體液分泌物(血液、骨髓、其他體液及排泄物)分離到細菌。脊柱影像學檢查異常。邀請該院具有較多臨床經驗的主任醫師對患者進行檢驗，判斷其是否為BS；并對患者的個人資料進行保存。

1.2.2 排除標準：患者有過強直性脊柱炎，曾做過脊柱外科手術、在進行檢查時，拍攝體位不正確，得到的圖像不符合要求，患有脊柱結核的患者。

1.3 分期及標準 臨床分期標準，依照我國在2012年最新修訂的《布魯氏菌病診療指南》為參考依據：(1)急性期：患病病程<6個月；(2)慢性期：患病過程>6個月。本研究經過(石家莊市第五醫院倫理委員會)認證，并經過患者家屬與本人同意。

1.4 標本采集 在對患有BS的患者進行血液樣本采集的時候，無論是哪一時期的患者，均要在采集當天保持空腹狀態，醫護人員從患者靜脈中抽出3 ml左右的血液，將其放置于事先準備好的含有EDTA的紫頭管和不含抗凝劑的采血管中。隨后將得到的血液樣本送至流式細胞儀中進行醫學檢驗，使用離心設備對得到的不抗凝管血標本進行處理。提取血清，并將其放在-80℃的環境下保管。等待檢驗分析。

1.5 主要實驗試劑 試劑包括FACS Lysing Solution，BD Intrasure，BD Trucount，CD3 FITC，CD3 FITC，Falcon，CD4抗體與Foxp3抗體、CD25抗體，使用的檢測設備購買于美國。使用的生物檢測儀為美國生產的全自動檢測儀，使用的檢測方法為免疫濁度法。

1.6 主要儀器與設備 (1)顯微鏡購于德國萊卡XS45B2；(2)BIO-RAD 細胞計數儀產自美國；(3)安亭牌水平離心機；(4)酶標儀產自美國品牌型號為BIO-RAD x Mark；(5)洗板機為TECAN，產自于奧地利；(6)流式細胞儀產自于美國，型號為FACS Canto_II。

1.7 T淋巴細胞亞群檢測方法 (1)在抽取患者身上血液樣本時，將其血液用含有EDTA的試管進行抽取儲存。(2)使用2個干凈的BD Trucount計數管，在其中1個計數管中加入CD3/CD8/CD45/CD4抗體的抗凝全血50 μl，并使其充分融合，在另一個計數管中加入同樣劑量的抗凝血，加入不同類型的抗體，具體為CD3/CD16+56/CD45/CD19。(3)將計數管中的液體充分搖晃均勻后，放在室溫下進行15 min的靜置處理。(4)待處理完成后，將450 μl 1×FACS的溶血素加入其中，并對其進行充分攪拌，再次靜置15 min。(5)上機檢測，檢測時，借助FACSCanto軟件完成檢測過程，并對得到的數據進行分析。

2 結果

2.1 BS患者臨床資料

2.1.1 臨床特征：觀察急性期BS和慢性期患者出現波狀熱，多汗，乏力，腰疼，自身活動受限，腰背，睪丸發脹并感覺疼痛情況。見表1。

表1 急性期與慢性期患者的臨床表現比較 例(%)

2.1.2 血清學檢查：對120例研究對象進行布氏桿菌凝集試驗，得到的檢測結果為陽性(100%)；急性期患者血沉(ESR)水平明顯升高，與慢性期患者和健康對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；急性期hs-CRP明顯升高與慢性期和健康對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 急性期、慢性期患者與健康對照組血清炎性因子檢測分析

2.2 T淋巴細胞亞群檢測

表3 急性期與慢性期的患者T淋巴細胞亞群檢測結果比較

3 討論

布魯菌病不僅具有較強的感染性與傳播性，且會對身體的各個系統帶來致命的威脅，在全世界范圍內流行，并且能夠實現人畜共患。主要多發于地中海、中東以及中南美洲的部分國家和地區[13]。我國當前患有BS的人數已高達30～50萬，并且每年的增長幅度均在5 000～6 000人[14]。此病常侵襲骨關節，在多種疾病入侵的過程中，對脊柱所造成的傷害最為嚴重。近幾年由于該疾病受到地域與職業的限制，在實際治療中，若使用影像學檢測與臨床癥狀表現對其病癥進行判斷，極易判斷錯誤，將其與脊柱結核等疾病混淆，所以如何準確的對BS做到準確的診斷是當前醫學治療所面臨的難題[15]。

3.1 臨床特征 BS在所有年齡段均可發生，本研究患者年齡16～69歲，絕大部分以男性為主，且他們的居住環境一般，從事的職業也都具有暴露因素。在對部分人群進行研究發現，在布魯菌病的患病人群中，男性出現BS的可能性更高[16]。其中腰部疼痛最為明顯，偶爾會伴有腰椎間盤過度勞累而引起的受累情況。原因在于，患者可能之前有過相關炎癥或者是周圍軟組織受損的癥狀。在此次研究中，患有急性期BS的患者有94%的人員有腰部疼痛的現象，而患有慢性期的BS患者中，也有87%左右的人員伴有腰部疼痛的反應。故在出現布魯菌病感染可能性較大的區域中，假如患者出現了腰部疼痛的臨床癥狀，需考慮BS。

3.2 實驗室檢查 患者ESR與hs-CRP的變化，都能夠幫助醫生對BS和椎間盤突出進行直觀分辨。在此次研究中，研究對象的上述兩項檢查結果全部高于正常水平，其中急性期患者明顯高于慢性期，提示急性期患者炎癥較重。使用ESR 與hs-CRP檢測的時候，能夠對感染人群做到識別，但對于 BS 的診斷缺乏特異性，所以只能將其看作評價 BS 活動性以及最終治療效果的一種參數[17]。病原菌的培養是診斷布魯菌病的金標準，但就目前的臨床研究可知，使用血培養得到的陽性率不高、培養條件較為苛刻、需要較長的培養時間，當前沒辦法將其作為診斷BS的常規檢測法。在本研究中，所有患者的布氏桿菌凝集試驗結果均為陽性，證明其具有良好的敏感度及特異度，且費用較低。因此，對BS的初步診斷需要依靠血清學指標。

3.3 T淋巴細胞亞群有關布魯菌病的病因與發病機制尚不清楚。布魯菌能夠通過消化系統、皮膚創口、口腔與鼻腔黏膜進行傳遞。布魯菌進入體內后，吞噬細胞會快速對一部分細菌進行吞噬，未被吞噬的細菌會在機體內快速繁殖與細胞相結合，隨著淋巴源性進行轉移，進入到血液循環中。此時被感染的血液中含有大量的內毒素，臨床反應為畏寒、發熱。由于布魯菌能夠在胞內寄生，從而導致T淋巴細胞介導的特異性免疫應答起到了主導作用。在整個布魯菌感染的過程中，T淋巴細胞免疫與細菌整個時期的活動都密切相關，在急性與慢性期中，機體所表現出來的免疫功能狀態皆不相同。在此次研究中我們對不同時期的BS患者做了研究，對其T淋巴細胞亞群做了詳細分析，探究患者體內免疫狀態的動態過程，為布魯菌病所出現的慢性化發展原因與機制作出理論總結。