維生素D和甲狀腺癌關系的研究進展

劉文斌 鄭海濤

甲狀腺癌是世界范圍內最常見的內分泌腫瘤，且世界各國甲狀腺癌的發病率持續上升[1]。隨著超聲的普及以及人們健康查體意識的增強，越來越多的甲狀腺癌患者被早期發現，甲狀腺癌的防治也引起了人們更多的關注。維生素D及其活性代謝物是人體骨骼健康的重要營養物質。紫外線照射皮膚可以將7-脫氫膽固醇轉化為維生素D3，維生素D3在肝臟和腎臟中代謝成活性形式-骨化三醇。它具有多種生物學效應，除了能維持鈣磷代謝平衡及骨骼健康之外，還能影響到機體多種細胞的增殖、分化和凋亡。本文回顧維生素D在甲狀腺癌中的研究進展，并就維生素D受體(VDR)與維生素D代謝關鍵酶在甲狀腺癌中差異性表達以及維生素D的抑癌機制進行分析，以期為甲狀腺癌的防治提供理論參考。

1 維生素D與甲狀腺癌的發生

1.1 維生素D與癌癥 維生素D以往被認為是一種必需的營養物質，也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，主要作用是調節骨代謝和鈣磷平衡。近幾年來，維生素D在非骨骼活動中的重要性已經被研究，大量研究表明，維生素D缺乏也與許多其他骨骼外疾病(如癌癥)的風險增加有關[2-5]。維生素D活性形式1，25-(OH)2D3主要與核維生素D受體(VDR)結合，控制200多個基因的表達，發揮生理作用[6，7]。肺、前列腺、卵巢和結直腸等組織都有VDR表達，并對1，25-(OH)2D3有反應。大多數流行病學研究及臨床數據表明，血清維生素 D 水平與多種癌癥風險相關，如結腸癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等，而且缺乏或低血清維生素D水平與增加患多種癌癥的風險之間存在相關性[8，9]。維生素D作為一種激素前體，在肝臟和腎臟中經歷兩步代謝，產生一種生物活性代謝物--鈣三醇，它與維生素D受體(VDR)結合，調節多種基因的表達。除經典代謝途徑外，有研究發現維生素D也可以通過Cyp11a1驅動的旁路代謝途徑被代謝和激活[10，11]。維生素D具有多種抗癌作用，如調控細胞增殖、分化、凋亡和抗血管生成等，對腫瘤的發展和發展有不同的影響。而維生素D信號的激活可能是預防和治療癌癥的一種新的策略。

1.2 維生素D水平與甲狀腺癌發生 目前，臨床上對甲狀腺癌致病原因及具體發病機制仍在探討中，有些學者認為化學毒素[12]、胰島素抵抗[13]、代謝綜合征[14]以及維生素D缺乏[15]等是甲狀腺癌的潛在危險因素。近年來，醫學界對血清維生素 D 有了新的認識，維生素D缺乏也被認為是甲狀腺癌的危險因素[16]。早在2010年，就已經有研究者在乳頭狀、濾泡狀、未分化性甲狀腺癌患者外周血中發現低濃度的1，25-(OH)2D3，并且在未分化性甲狀腺癌中檢測到的1，25-(OH)2D3含量最低[17]。這表明維生素D低水平患者可能增加患有甲狀腺癌的風險。同樣，Roskies等[18]記錄了接受甲狀腺切除術患者術前維生素D濃度，將37.5 nmol/L 作為既定閾值(低于既定閾值為維生素D缺乏)，并根據術后病理情況進行數據分析，結果發現在甲狀腺癌患者中維生素D往往是缺乏的。另外，有學者通過計算多分類變量邏輯回歸來評估維生素D和乳頭狀甲狀腺癌(PTC)之間的關系，發現血漿中高水平25-(OH)D會降低患PTC的風險[19]。這表明高水平維生素D有利于甲狀腺癌的預防，維生素D攝入量可被視為甲狀腺癌發病率的預防因素。

1.3 維生素D水平與甲狀腺癌病理分期 Stepien等[17]不僅發現甲狀腺癌中維生素D水平低，也發現惡性程度高的未分化癌中維生素D水平最低。甚至，有人推測試圖維生素D缺乏程度會影響甲狀腺癌病理分期，Kim 等[20]對接受甲狀腺全切除術的548名女性PTC患者，根據術前血清25-(OH)D水平，回顧性分析PTC的臨床病理特點，結果發現腫瘤>1 cm 或有淋巴結轉移的患者術前維生素 D 水平明顯降低。并且，根據易詩瓊等[21，22]的研究結果顯示，血清維生素D濃度與甲狀腺癌的浸潤深度及分期呈負相關，與腫瘤分化程度呈正相關，且為影響甲狀腺癌患者預后的獨立危險因素。但是又有研究顯示,維生素D缺乏與PTC的惡化與轉移似乎并無明顯關系[23，24]。Yildiz 等[25]針對179例行甲狀腺切除的患者，于手術前1 d采血，測得血清25-(OH)D水平，將維生素D濃度分為<10 ng/ml、11～20 ng/ml、20～29 ng/ml和≥30 ng/ml 4組，分別對術后病理、淋巴結情況進行數據分析，結果顯示4組維生素濃度在良惡性腫瘤中以及淋巴結轉移中均無顯著差異。這些報道的不一致性，可能與受試者的選擇、地區因素、VDR多態性等有關。

2 維生素D信號通路與甲狀腺癌

2.1 維生素D信號通路 維生素D3與血液中的維生素D結合蛋白結合后被運輸到肝臟，在肝臟經過25-羥化酶(CYP2R1、CYP27A1)催化下轉變為25-羥維生素D3[25-(OH)2D3]；進入血液循環后同樣與維生素D結合蛋白結合，隨后被運輸到腎臟，在腎臟1α-羥化酶(CYP27B1)催化下生成具有激素活性的代謝產物1,25-二羥維生素D3[1，25-(OH)2D3]，而1，25-(OH)2D324-羥化酶(CYP24A1)主要參與維生素D的分解代謝。[1，25-(OH)2D3]是的維生素D的生物活性狀態，它主要通過基因組以及非基因組途徑與維生素D受體(VDR)結合發揮抗腫瘤增殖、分化和免疫調節作用。在基因組通路中，核維生素D-nVDR與維甲酸-X-受體(RXR)形成異二聚體復合體，并與維生素D反應元件(VDRE)結合，觸發下游目標CDKN1A、C-MYC、Cdh1和CYP24A1的轉錄。1，25-(OH)2D3的非基因組作用主要表現為激活信號分子如磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷脂酶C和磷脂酶A2(PLA2)和 p21ras，其次是快速生成次級信使如環磷酸腺苷(camp)、鈣離子(Ca2+)、脂肪酸和3-磷酸肌醇(3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇)。這導致相應蛋白激酶的激活。此外，非基因組作用還包括Ca2+和 Cl-通道的開放。據報道，wnt/β-catenin信號通路在PTC的發生、發展中起重要作用[26，27]。在Pang 等[28]的研究中VDR-KD可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，減弱維生素D在PTC中的抗增殖、促凋亡和抗侵襲作用。這也反應出VDR可以作為治療甲狀腺癌的一種新的靶點，可應用于今后的臨床實踐，提高甲狀腺癌患者的臨床療效。

2.2 基因多態性 近年來，大量研究發現維生素D受體(VDR)基因限制性片段長度多態性與各種類型癌癥的相關性。Kostner等[29]對之前發表過的研究進行meta分析，發現VDR基因多態性與乳腺癌(Fok 1，Bsm1，Taq 1，Apa 1，polyA)，前列腺(Fok 1，Bsm1，Taq 1，polyA)，皮膚(Fok 1，Bsm1，A-1210)，直腸癌(Fok 1，Bsm1)，卵巢(Fok 1，Apa 1)和膀胱(Fok1，Apa 1)及腎癌(Taq1，Apa 1)均有明顯的相關性。為了了解VDR多態性與甲狀腺癌的聯系，Penna-Martinez等[30]對172例甲狀腺癌患者(乳頭狀癌132例，濾泡狀癌40例)和321例健康對照組(HC)的VDR基因多態性位點 ApaI、TaqI、BsmI和FokI進行對比分析，結果發現ApaI (rs7975232)的AA和 FokI (rs10735810)的FF等位基因與單倍體型tABF在濾泡性甲狀腺癌(FTC)患者中的發生率明顯低于HC，而單倍體型Tabf在FTC患者的發生率則較高，相比之下，無論是基因型還是單倍體型在PTC與HC之間都沒有差異，這項研究表明ApaI、FokI的等位基因AA和FF以及單倍型tABF是FTC的保護因素，而單倍型Tabf是FTC的風險因素。這是第一個將 VDR 多態性與甲狀腺癌聯系起來的報告，尚需要在更多患者的研究中得到證實。隨后，有研究報道了CYP27B1的罕見單倍型rs10877012A/rs4646536T可能對 PTC 有保護作用，而且還報道了CYP24A1 rs2296241多態性與DTC的關系，含有rs2296241等位基因的單倍型rs2248137C/rs2296241A對PTC有保護作用，而單倍型rs927650C/rs2296241G和rs927650C/rs2248137C/rs 2296241G可能增加DTC風險，尤其是對FTC影響較大[31]。維生素D通路中的基因多態性對甲狀腺癌的影響，Carvalho等[32]的研究發現CYP2R1 rs2060793小等位基因(A等位基因)在DTC的淋巴結或遠處轉移患者中的頻率較低，而DHCR 7(調節維生素D3的關鍵酶) rs12785878小等位基因(G等位基因)在DTC患者中的頻率增加，這表明DHCR 7 rs12785878是甲狀腺癌新的危險位點，CYP2R1 rs2060793可能具有預防甲狀腺癌進展的作用。在甲狀腺髓樣癌(MTC)的研究中，Ramezani等[33]提取MTC和健康者VDR基因組DNA，進行PCR測序。結果發現FokI和BsmI多態性的基因型和等位基因頻率在試驗組和對照組之間沒有顯著性差異。而在Tru9I多態性上，試驗組Tt基因型和t等位基因頻率與對照組比較有顯著差異性(P<0.05)。同時，該研究發現Tt基因型和t等位基因頻率與MTC類型和病情加重密切相關，這也反應出Tru9I多態性與甲狀腺髓樣癌的患病率相關。以上的研究結果說明維生素D受體的多態性可以影響甲狀腺癌的發病率。

2.3 VDR、CYP27B1和CYP24A1 VDR蛋白介導維生素D的抗腫瘤效應，而CYP27B1和CYP24A1參與1，25-(OH)2D3代謝。Clinckspoor等[34]通過免疫組化與實時定量RT-PCR技術分析，與正常甲狀腺相比，DTC和良性甲狀腺腫瘤中VDR、CYP27B1和CYP24A1的表達均增加。可能的解釋是在局部腫瘤組織中維生素D代謝失活阻斷了維生素D的快速抗腫瘤反應，并提示1，25-(OH)2D3具有一定的抗腫瘤作用。在DTC與良性甲狀腺腫瘤比較中，DTC患者VDR升高更明顯，CYP24A1表達則較低，CYP27B1表達相似。這提示在DTC患者中，可能通過VDR的高表達與CYP24A1的低表達來增強1，25-(OH)2-D3的抗腫瘤作用。另外，在有淋巴結轉移的PTC中，VDR和CYP24A1較未轉移的PTC降低；在ATC中，VDR的表達常缺失，而CYP27B1和CYP24A1的表達與DTC相當；Ki 67高表達(>30%)或遠處轉移的ATC以VDR、CYP24A1、CYP27B1染色陰性為特征。這表明隨著腫瘤惡性程度增高，1，25-(OH)2D3的信號通路會減弱。這也在Yavropoulou等[35]研究中得到印證。

2.4 nVDR和mVDR 傳統上，1，25-(OH)2-D3的生物學效應被認為是通過它與細胞核維生素D受體(nVDR)的相互作用來實現的。在20世紀80年代中期，人們觀察到VDR在調節基因表達的同時，還通過非基因調控方式介導了一些細胞內的迅速改變，例如參與細胞內信號轉導通路，這引起了科學界的興趣?；谝恍┎荒芘cnVDR結合的維生素D類似物能夠引起1，25-(OH)2D3的快速反應，有人發現一種獨特的細胞膜mVDR[36]，這種mVDR可以顯示在細胞表面和核周區域，而不是在細胞核內。在質膜上，維生素D受體定位于腔隙，結合腔隙蛋白-1和磷脂酶A2[37，38]。但對于nVDR是否參與1，25-(OH)2D3的非基因組作用一直存在一些爭論。易詩瓊等[21]試圖闡明VDR在甲狀腺癌中的表達模式，他們分析PTC中濾泡狀癌細胞及其周圍非腫瘤性甲狀腺組織(NNTT)VDR的表達，腫瘤組中VDR mRNA 和蛋白表達均高于 NNTT 組，并且在所有的病例中，VDR蛋白質全部定位于細胞質和細胞膜中，大多數病例細胞質陽性率較高，而NNTT細胞膜陽性率比癌細胞的低。雖然不能確定PTC中膜性mVDR表達增加是從細胞核到細胞膜的VDR易位還是膜VDR表達的本身增加，但膜mVDR表達的增加可作為濾泡性甲狀腺細胞對異常腫瘤細胞增殖的補償機制。

2.5 CYP24A1與甲狀腺癌的治療 人們推測維生素D信號通路的阻斷可能是甲狀腺癌發生發展的原因之一，在此基礎上，通過維持正常的維生素D信號通路，如通過抑制CYP24A1的代謝作用或補充1，25-(OH)2D3可能有助于甲狀腺癌的治療。從Hu等[39]的研究中發現在ATC細胞系中將CYP24A1基因敲除后，甲狀腺癌細胞的增殖受到明顯抑制，并且CYP24A1基因敲除可明顯增強1，25-(OH)2D3對癌細胞的抗增殖作用。這可以從側面反應出抑制CYP24A1的代謝可能有助于甲狀腺癌的治療。先前有多項研究顯示CYP24A1抑制劑在前列腺癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等能增強1，25-(OH)2-D3的抗腫瘤細胞增殖活性，但在甲狀腺癌中的臨床應用尚未有明確報道。但有研究顯示PTC組織中CYP24A1表達增加，在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤中表達進一步增加，他們認為CYP24A1的過表達與BRAF(V600E)突變密切相關，BRAF(V600E)抑制劑PLX 4720能顯著下調CYP24A1的表達，增強1，25-(OH)2D3在甲狀腺癌細胞中的抗增殖作用。目前仍需要有更多的研究來證明CYP24A1抑制劑在甲狀腺癌中的作用[40]。另外，Sharma等[41]用VDR激動劑(骨化三醇或 DP006)治療甲狀腺癌6 d后，用活細胞分析法檢測細胞生長情況。他們發現具有FF FokI VDR 基因型的細胞系中CYP24A1 基線水平較高，且對VDR激動劑的反應較弱，經VDR激動劑治療后對癌細胞生長無明顯抑制作用，可能的原因是高水平的CYP24A1導致1，25-(OH)2D3的局部快速失活，存在活性較低的1，25-(OH)2D3可用于 VDR 的結合和激活。而具有ff FokI VDR 基因型的細胞系CYP24A1基線水平較低，對VDR激動劑治療后反應較大，甲狀腺癌細胞存活數量減少。他們推測通過分析甲狀腺癌細胞中對VDR激動劑治療敏感或耐藥的可識別標記物，可能有助于甲狀腺癌的個體化治療。由此，在甲狀腺癌的治療方面，將來可以從結合CYP24A1抑制劑以提高1，25-(OH)2D3治療效果方面展開進一步研究。

3 維生素D與甲狀腺癌細胞的增殖、分化、凋亡

3.1 維生素D抑制甲狀腺癌細胞增殖 1，25-(OH)2D3具有較強的抗腫瘤活性作用。以往的研究表明，1，25-(OH)2D3可通過降低轉錄因子E2F1的表達或介導CDKI-p27的積累使停滯在G0-G1期的甲狀腺癌細胞比例增加，進而發揮抗腫瘤細胞增殖效應[42-45]?，F普遍認為腫瘤干細胞(CSCs)與腫瘤的發生、復發和轉移有關，而甲狀腺正常干細胞基因突變后能夠演變成腫瘤干細胞(CSCs)，最終發展成甲狀腺癌[46]。Peng等[47]發現1，25-(OH)2D3能通過細胞周期阻滯抑制甲狀腺未分化癌細胞來源的CSCs的增殖，并且能在甲狀腺CSCs中發揮促進分化的作用。而CSCs又與上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)具有關聯性[48，49]。人甲狀腺癌細胞可通過完成EMT，促使甲狀腺CSC的發生[50]。有研究發現，1，25-(OH)2D3可以抑制甲狀腺CSCs 的 EMT 的轉化，進而抑制甲狀腺腫瘤細胞的干性[51]。并且這項研究還提示EMT過程或許可以作為維生素 D 抗甲狀腺 CSCs 的潛在靶點，提高未分化型甲狀腺癌的臨床療效，改善患者預后。

3.2 維生素D促進甲狀腺癌細胞分化 已有眾多研究證明1，25-(OH)2D3可促進如白血病細胞、結腸癌細胞等多種癌細胞分化，但對甲狀腺癌細胞的研究相對較少。Dackiw等[52]將人甲狀腺濾泡癌(FTC)衍生細胞(WRO)移植于小鼠頸部，經1，25-(OH)2D3處理后的小鼠腫瘤體積明顯小于對照組，肺轉移發生率也較低。切除腫瘤標本后進一步研究發現用1，25-(OH)2D3處理的小鼠顯示甲狀腺球蛋白染色恢復分化的跡象。這與p27蛋白恢復在甲狀腺癌細胞中的積聚有關。這項研究結果表明1，25-(OH)2D3可以抑制小鼠體內FTC細胞增殖、預防腫瘤轉移，還可以誘導其分化。另外，有研究表明在體外ATC細胞系中，經1，25-(OH)2D3處理后，分化指標鈉/碘轉運體和甲狀腺球蛋白mRNA的表達僅略有增加，對促甲狀腺激素受體和甲狀腺過氧化物酶mRNA的表達無明顯影響[31]。但是該項研究者也提出，由于甲狀腺癌細胞系是原始腫瘤細胞的體外培養的結果，它們可能已經失去了對抗癌藥物的敏感性[31]。1，25-(OH)2D3及其類似物CD578在該研究中的細胞系影響明顯，并不完全代表在未分化的甲狀腺癌中效果明顯，這是進一步進行體內研究的有力依據?？傊?，目前有較少的確切證據證明維生素D能促進甲狀腺癌細胞分化。

3.3 維生素D誘導甲狀腺癌細胞凋亡 1，25-(OH)2D3不僅能抑制腫瘤細胞增殖、誘導其分化，對促使腫瘤細胞凋亡也起重要作用[53]。腫瘤細胞凋亡的調控在腫瘤發生、發展過程中具有非常重要的作用，雖然Clinckspoor等[34]沒有發現1，25-(OH)2D3影響甲狀腺腫瘤干細胞的凋亡，但是有人發現活性氧(ROS)在化療藥物誘導的細胞凋亡中起重要作用，而1，25-(OH)2D3可調節ROS的產生[54-56]。Zhang等[57]將1，25-(OH)2-D3單獨處理ATC細胞，未發現1，25-(OH)2D3誘導ATC細胞凋亡。而阿霉素(ADM)可誘導ATC細胞凋亡，并且經高濃度1，25-(OH)2D3預處理ATC細胞后，可明顯增加ADM誘導的ATC細胞凋亡。他們繼續深入研究，用H2-DCFDA法測定ATC細胞內ROS的產生，結果發現1，25-(OH)2D3不能增加 ATC 細胞內 ROS 的產生，而ADM可增加ROS的產生，并且高濃度1，25-(OH)2D3和ADM聯合治療后可顯著增加細胞內ROS的產生。為了進一步明確ROS和ATC細胞凋亡的關系，研究者將抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)用作細胞內活性氧清除劑，發現NAC可抑制1，25-(OH)2D3和ADM聯合治療誘導的 ATC 細胞凋亡。以上研究結果表明，雖然1，25-(OH)2D3不能直接誘導甲狀腺癌細胞凋亡，但它可促進ADM治療后ATC細胞內活性氧的產生，進而增強ADM導致的細胞凋亡效應。

RAS-MEK-ERK，在近幾十年深入研究基礎上，已成為一條經典的腫瘤信號傳導通路。這條信號通路與多個癌種的發生密切相關，調控著腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡。最近，Li等[58]從這一經典信號通路入手，探討1，25-(OH)2D3在甲狀腺乳頭狀癌的增殖和凋亡中可能的機制。經1，25-(OH)2D3處理甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞系后，細胞增殖、集落形成和遷移能力明顯降低。凋亡細胞數明顯增加，Ki 67蛋白表達降低，Caspase-3蛋白表達上調。RAS、p-ERK 1/2和p-MEK的磷酸化水平降低。與之相比，1，25-(OH)2D3+ML-098(RAS激動劑)處理TPC-1細胞系后，細胞的集落形成和遷移能力明顯增強。凋亡細胞數減少，Ki 67蛋白水平升高。Caspase-3蛋白水平降低，Ras-MEK-ERK水平升高.而且，1，25-(OH)2D3的抗腫瘤活性被RAS激動劑ML-098逆轉。由此可見，11，25-(OH)2D3可能通過抑制Ras-MEK-ERK途徑的活性，抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1的活性，促進細胞凋亡。

分化型甲狀腺癌(DTC)的治療目前首選手術，且手術預后效果較好。但使用標準的積極手術治療的決定仍然是有爭議的，美國甲狀腺協會(ATA)指南推薦的治療方法更為保守[59]，高危患者是積極治療的，低風險患者可能更適合保守治療?，F影響甲狀腺癌發病的關鍵信號通路的分子機制從理論向臨床實踐轉變，可以為每個DTC患者提供更多的治療方案。

維生素D信號在甲狀腺癌中起重要作用，無論是作為單一的藥物還是與其他抗腫瘤藥物聯合治療，靶向維生素D信號轉導被認為是治療甲狀腺癌的一個很好的選擇。雖然維生素D在甲狀腺癌治療中的作用仍然是模糊的，我們期待未來的臨床試驗通過探索維生素D在甲狀腺癌中的作用機制，用適當劑量的維生素D或其類似物，以及聯合化療藥物來治療甲狀腺癌患者，從而達到經濟有效的目的。