基于生物信息學分析CD93基因在肺鱗癌中的表達及其化療敏感性和預后的關系

郭榮，宋愛萍，岳文靜，高業

巴彥淖爾市醫院臨床藥學科，巴彥淖爾 015000

腫瘤是機體正常細胞經過突變積累后，在體內不斷增殖和遷移的一種細胞惡變產物。盡管健康機體具有一系列的免疫監視機制，但仍難以阻止腫瘤的發生和發展。少量的腫瘤細胞不易引起機體應答，待腫瘤生長至一定程度，超越了機體免疫應答的能力，腫瘤細胞即可逃逸，導致腫瘤的發生。手術、放療、化療是常用的腫瘤治療方案，但療效差強人意。

腫瘤免疫治療是通過重新啟動并維持免疫系統對腫瘤細胞的識別和殺傷，恢復機體正常的抗腫瘤免疫能力，從而控制與清除腫瘤的治療方法。這種療法不僅臨床療效好，而且還避免了對機體的損傷。因此，腫瘤免疫治療已成為現今腫瘤領域的新希望。腫瘤免疫治療形式多種多樣，如程序性死亡受體-1（programmed death receptor 1，PD-1）免疫檢查點抑制劑、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）受體抑制劑[1]、嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞療法[2]、腫瘤疫苗[3]等。其中，免疫檢查點抑制劑是現今腫瘤免疫治療的熱點。但隨著臨床應用的深入，研究人員發現只有少數患者可以從免疫檢查點抑制劑治療中獲益[4]。因此，尋找新的生物標記物來預測腫瘤免疫治療的療效，發現新的靶點來研究新的免疫檢查點藥物，已成為目前臨床研究人員急需解決的問題。

白細胞分化抗原93 （leukocyte differentiation antigen 93，CD93），在許多實體瘤中過表達，阻斷CD93能夠促進藥物遞送和免疫治療效果，提示其可能成為實體瘤治療的新靶點[5-6]。CD93在細胞內鈣通道的激活信號、受體介導的信號轉導、淋巴細胞黏附的調節中發揮作用[7]。CD93基因是人類原發性腫瘤血管生成基因中最重要的基因之一，主要表達于腫瘤血管系統，是腫瘤新生血管發生和發展過程中的關鍵分子。CD93作為一種跨膜糖蛋白，最主要的表達部位是內皮細胞。CD93表達主要限于內皮細胞間連接，并積極參與多種細胞生物過程，包括細胞-基質黏附、細胞遷移、信號轉導、干細胞分化、免疫應答和血管生成等。相關文獻報道[8-9]提示CD93是一種新型血管生成激活劑，主要通過促進內皮細胞黏附，加速腫瘤血管再生，從而加速腫瘤生長并縮短宿主存活時間。

目前，CD93在肺鱗癌組織中的研究，作者未見相關文獻報道。本研究采用生物信息學方法，分析了CD93基因在肺鱗癌組織中的表達情況，同時分析了CD93表達水平與肺鱗癌免疫微環境、化療敏感性和預后的關系，為肺鱗癌提供新的生物分子標記物。

1 資料與方法

1.1 數據獲取

TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/），是由美國國家癌癥研究所和國家人類基因組研究所合作建立的癌癥研究項目，提供了一個免費的全方位的癌癥研究參考數據庫，收集整理了癌癥相關的數據，涵蓋了表觀遺傳、基因組、轉錄組、蛋白組等多個組學數據；收錄了肺鱗癌的轉錄組表達數據，包括癌組織和正常組織，Xena（https：//xenabrowser.net）為該數據庫提供了標準化數據。本研究探討了CD93在肺鱗癌組織中表達量的數據，Xena對所用的TCGA數據庫中的數據進行了log化處理。

1.2 CD93在肺鱗癌組織中的差異表達

從TCGA數據庫下載肺鱗癌轉錄組數據 （包括502個肺鱗癌組織，51個癌旁組織），使用R軟件進行基因差異表達分析，比較CD93表達在肺鱗癌組織與癌旁組織中的表達差異。

1.3 基因富集分析

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探討CD93參與的肺鱗癌發生發展的相關信號通路；采用加權富集法進行分析，隨機組合次數設為1000次，其他參數均按默認值設置。將P<0.05和錯誤發現率（falsediscovery rate，FDR）<0.05的基因集作為顯著富集的基因。

1.4 肺鱗癌組織中CD93表達與腫瘤免疫微環境的關系分析

采用單樣本基因集富集分析（ssGSEA）來評估CD93表達與肺鱗癌免疫微環境中24種免疫細胞的相關性。24種免疫細胞分別為：活化樹突狀細胞（aDC）、B細胞、CD8 T細胞、骨髓來源的抑制性細胞（MDSC）、樹突狀細胞（DC）、嗜酸性粒細胞、未成熟的樹突狀細胞 （iDC）、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞（NK）、NK-CD56亮細胞、NK-CD56暗細胞、漿細胞樣DCs （pDCs）、調節性T細胞、T輔助細胞、中央記憶型T細胞（Tcm）、效應性記憶T細胞（Tem）、濾泡輔助性T細胞（Tfh）、gamma delta T細胞（Tgd）、輔助性T1細胞（Th1）、Th17細胞、Th2細胞和調節性T細胞（Treg）。基于表達譜數據，采用單樣本基因集富集分析可以推斷這24種免疫細胞的相對豐度。

1.5 CD93表達水平與肺鱗癌預后關系分析

根據CD93 mRNA表達量的中位數，將患者分為高表達組和低表達組，采用Kaplan-Meier法制作生存曲線圖。采用log-rank 檢驗計算兩組（以中位數區分）生存差異P值，P<0.05為具有統計學差異。

1.6 CD93表達水平與化療敏感性分析

根據CD93 mRNA表達量的中位數，將患者分為高表達組和低表達組，采用pRRophetic法預測其對化療藥物的IC50值。

1.7 統計學處理

采用R4.0.1統計學軟件對數據進行統計分析。采用t檢驗比較CD93在肺鱗癌組織和癌旁組織中的表達差異；采用非參數Sperman秩相關分析來計算CD93基因與肺鱗癌組織微環境中免疫細胞的相關性；采用Kaplan-Meier法分析CD93高低表達組之間的生存率差異，P<0.05為具有統計學差異。本研究中，統計分析和作圖所用的R包為ggplot2、ggsignif、enrichplot、clusterprofile、gsva、survival。

2 結果

2.1 CD93在肺鱗癌和癌旁組織的表達差異分析

采用R包對CD93在肺鱗癌組織和癌旁組織中的表達差異進行對比分析，結果如圖1所示。表達量數據經過log化處理后符合正態分布，經t檢驗后發現，CD93在癌旁組織中的表達量高于肺鱗癌組織中的表達量，具有統計學差異（P<0.05）。

圖1 CD93在肺癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 基因富集分析

通過GSEA法分析CD93在免疫反應相關信號通路中的富集水平，結果見圖2。

圖2 GSEA富集通路

2.3 CD93與肺鱗癌免疫細胞浸潤的相關性

通過ssGSEA算法分析CD93表達與肺鱗癌微環境中不同類型免疫細胞的相關性，見圖3。其中，橫軸表示CD93的表達與免疫細胞的相關性，離中心越遠，說明相關性越強；點的大小代表相關性，點越大，相關性越強。由結果可知，CD93表達水平與漿細胞樣樹突狀細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、調節性T細胞、骨髓來源的抑制性細胞呈正相關，具有統計學差異（P<0.05）。

圖3 CD93的表達與肺鱗癌組織免疫細胞浸潤的相關性

2.4 CD93表達與肺鱗癌患者預后的關系

采用Kaplan-Meier法分析CD93高表達組和低表達組總體生存率的差異，結果見圖4。發現高表達CD93組中肺鱗癌患者的總體生存率高于低表達組，具有統計學差異（P<0.05）。這一現象與CD93在肺癌組織和正常組織之間的差異表達結果趨于一致。

圖4 CD93的表達與肺鱗癌患者預后的關系

2.5 CD93與腫瘤藥物的敏感性

利用pRRophetic算法[10]，使用GDSC（the Genomics of Drug Sensitivity in Cancer）數據庫預測肺鱗癌組織CD93表達水平對化療藥物IC50值的影響，見圖5。結果發現對于紫杉醇、長春瑞濱、多西他賽、順鉑等化療藥物，在CD93低表達的肺鱗癌組織中IC50值較低，顯示其對相關化療藥物敏感。

圖5 CD93表達與化療藥物的敏感性預測

3 討論

肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率居癌癥之首。肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），而非小細胞肺癌約占肺癌的80%～85%，其中肺鱗癌約占非小細胞肺癌的15%～20%。相對于肺腺癌，肺鱗癌的靶向藥物相對較少[11]，化療的可選擇性較少，因此患者生存率差強人意。隨著腫瘤免疫治療的到來，肺鱗癌免疫基因組學分型及預測模型構建，為肺鱗癌患者帶來新的希望[12]。

本研究采用生物信息學方法，研究了CD93基因在肺鱗癌組織和正常組織中的表達差異。相對于正常組織CD93在肺鱗癌組織中是低表達的，這與其他基因的表達情況一致[13]。由于CD93基因主要參與內皮細胞的增殖、遷移和新生血管的生成，是人類原發性腫瘤血管生成基因標記中的高突變基因之一[5]。因此，相對于正常組織，CD93低表達的可能原因是CD93基因在肺鱗癌組織中產生了突變。對于CD93基因突變和表達量之間的關系情況，本研究將繼續研究與探討。

腫瘤的免疫治療是當前腫瘤治療領域的研究熱點。隨著研究的深入，對于腫瘤微環境、發現有意義的腫瘤免疫靶點一直是腫瘤免疫治療的研究熱點。相關研究顯示[5]，阻斷CD93信號通路可增加腫瘤內效應T細胞的數量，增強抗腫瘤免疫反應。本研究中GSEA分析表明CD93基因對于免疫信號通路如干擾素α反應、干擾素γ反應，在CD93高表達組中均有富集。同時，通過分析CD93mRNA在肺鱗癌組織中的表達，發現CD93與大多數免疫浸潤淋巴細胞密切相關，特別是漿細胞樣樹突狀細胞和調節性T細胞。漿細胞樣樹突狀細胞和調節性T細胞在腫瘤免疫逃逸中扮演重要的角色，因此，我們推測CD93的表達可能與肺鱗癌的免疫抑制微環境有一定的相關性。

本研究預后分析發現，CD93低表達的患者預后反而劣于高表達CD93的患者，分析其可能原因：①CD93基因可能發生了一定程度的突變，影響了CD93的表達。② 本研究證實CD93激活了一些免疫通路，這些激活的免疫通路可能使肺鱗癌腫瘤微環境發生了一定的動態變化，間接導致腫瘤細胞的凋亡，從而延長了患者的生命周期。而CD93激活了哪些免疫通路，引起了腫瘤微環境的動態變化，有待進一步研究證實。

目前，傳統的細胞毒性藥物是肺鱗癌的常見治療藥物[14]。本研究嘗試預測不同CD93表達水平的肺鱗癌亞型對化療藥物的敏感性，結果發現對于長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽、順鉑，其高表達CD93水平IC50值高于低表達CD93水平，說明CD93高表達水平對化療可能不敏感。

本研究不足之處在于因GDSC數據庫收集了傳統化療藥物，而對于靶向藥物、免疫檢查點藥物沒有進行收錄。因此，本研究尚不能對當前肺鱗癌治療的靶向藥物和免疫藥物進行預測。相信隨著研究的進步和大數據的普及，未來可以實現這一目標。

本研究證實了CD93在肺鱗癌預后中的重要作用，同時證實了CD93基因低表達與患者預后有一定的相關性，CD93的表達與肺鱗癌免疫細胞浸潤水平密切相關，并可調控相關的免疫信號通路。在未來的研究中，我們將進一步探索CD93在肺鱗癌細胞中的功能，并對其分子機制進行深入探討。

合理用藥科普

肺鱗癌的典型癥狀

（一） 發熱

首發癥狀者占20%～30%。肺鱗癌所致的發熱原因有2種：①炎性發熱，多在38℃左右，很少有超過39℃的情況。抗菌藥物治療可能有一定治療效果，但因分泌物引流不暢，常反復發作。②癌性發熱，多由腫瘤壞死組織被機體吸收所致，此種發熱抗炎藥物治療無效，激素類或吲哚類藥物有一定的臨床療效。

（二） 咳嗽

咳嗽是最常見的癥狀，以咳嗽為首發癥狀者占35%～75%。肺鱗癌所致的咳嗽可能與支氣管黏液分泌的改變、阻塞性肺炎、胸膜侵犯、肺不張及其他胸內合并癥有關。對于吸煙或患慢性支氣管炎的患者，尤其是老年人，如出現咳嗽程度加重，次數變頻；咳嗽性質改變如呈高音調金屬音時，要高度警惕癌變的可能性。

（三） 痰中帶血或咯血

痰中帶血或咯血亦是肺癌的常見癥狀，以此為首發癥狀者約占30%。由于腫瘤組織血供豐富、質地脆，劇咳時血管破裂而致出血，咳血亦可能由腫瘤局部壞死或血管炎引起。咳血的特征為間斷性或持續性、反復少量的痰中帶血絲，或少量咯血，偶因較大血管破裂、大的空洞形成或腫瘤破潰入支氣管與肺血管而導致難以控制的大咯血。

（四） 胸痛

首發癥狀者約占25%。常表現為胸部不規則的隱痛或鈍痛。

摘自公眾號：CPhI制藥在線