連翹提取物通過調節巨噬細胞凋亡和極化抑制LPS 誘導的炎癥作用

羅福龍李文舉吳小會鐘 武范 蓓貫東艷王鳳忠?王 瓊?

(1.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193;2.西南醫科大學附屬醫院急診科,四川 瀘州 646000;3.四川省康復醫院,成都 611139;4.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科,重慶 400016)

炎癥的發生發展是一個時刻變化的過程,主要通過自身免疫系統實現對機體的自我保護作用[1]。炎癥反應在人體內普遍存在,不僅可以減輕和消除有害因子對人體的損傷,還可以促進后期的組織修復,但免疫系統的過度激活,會促使炎癥因子的大量釋放,形成“細胞因子風暴”[2],發生嚴重的不良反應,甚至危及生命。

巨噬細胞作為炎癥性疾病最主要的免疫防御細胞,可以釋放促炎介質促進炎癥因子的形成[3]。巨噬細胞的可塑性和功能極化作用在炎癥反應中發揮著重要作用[4],巨噬細胞在特定微環境下,可以發生M1 和M2 表型的轉化,在炎癥反應的早期,M1 型巨噬細胞可以分泌多種促炎因子,如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白細胞介素-12(IL-12)、IL-6、IL-1β 等,通過增強其自身的抗原提呈能力來激活I 型免疫反應,引起組織細胞損傷阻止炎癥反應進程。 與之相反,M2 型巨噬細胞可以分泌多種炎癥抑制因子,如IL-10、IL-4、精氨酸激酶-1(Arginase-1)、CD206 等,通過抑制炎癥反應的發展,促進組織損傷的自我修復過程[5-6]。脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS) 可以模擬炎癥反應的早期階段,通過誘導M1 型巨噬細胞的分化[7-8],促進炎癥的發生。

中藥免疫調節在炎癥過程中發揮著重要作用,其內在機制可能與巨噬細胞M1 和M2 表型的平衡有關。 連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl.是木犀科連翹屬植物,連翹果實作為中藥在我國被廣泛應用[9],但連翹對巨噬細胞凋亡和極化的研究鮮有報道。 因此,本研究采用LPS 誘導體外培養RAW264.7 巨噬細胞的極化模型,探討了連翹提取物(FSE)對LPS 誘導的巨噬細胞ROS 和細胞凋亡,以及M1/M2 型相關標志基因的影響,初步探討FSE 在巨噬細胞發揮抗炎作用的內在機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

小鼠RAW264.7 巨噬細胞來自于北京大學醫學部。

1.2 主要試劑與儀器

連翹產自山西,購自北京太洋樹康藥業有限責任公司(批號2012054),經水提、濃縮、噴霧干燥、粉碎而成;DMEM 培養基(Thermo Scientific,批號11965092) ;胎牛血清(Gibco,批號:10099141);LPS (Sigma 公司,批號12880) ;一氧化氮檢測試劑盒(碧云天,批號:S0021);Hoechst33342(碧云天,批號:C1022);DCFH-DA 活性氧ROS 熒光探針(索萊寶,批號:D6470);MTT 試劑盒(索萊寶,批號:M1020);EASYspinPlus 組織/細胞RNA 快速提取試劑盒(艾德萊,批號:RN28);反轉錄試劑盒(普洛麥格,批號:A5000);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein,批號:E096-01B);Real-time PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)。

細胞培養箱(美國,Thermo 公司,型號:Thermo 371);酶標儀(美國,Molecular Devices 公司,型號:spectra MAX190);熒光倒置顯微鏡(日本,Olympus公司,型號:IX71);RT-PCR 擴增儀(美國ABI 公司,型號:ABI 7500);可見紫外分光光度計(上海尤尼柯公司,型號:WFZ UV-2100);低溫高速離心機(德國,Eppendorf 公司,型號:5430R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RAW264.7 的培養與分組

RAW264.7 細胞復蘇后,以含10%胎牛血清的DMEM 培養基,5%的CO2、37℃恒溫培養箱培養細胞,每隔24 h 觀察細胞狀態并換液和傳代,取對數生長期細胞進行實驗,以每毫升1×104個的細胞密度接種于96 孔板,每孔100 μL;或以每毫升1×106個細胞密度接種于6 孔板,每孔2 mL。 接種24 h 后進行實驗,實驗設置對照組,LPS 組(500 ng/mL),加藥組(6.25、12.5、25、50 μg/mL),首先加入不同劑量連翹提取物作用2 h,再每孔加入500 ng/mL 的LPS 溶液共同刺激36 h。

1.3.2 MTT 法檢測FSE 和LPS 對RAW264.7 細胞的毒性作用

取處于對數生長期的RAW264.7 細胞接種于96 孔板,加入不同濃度的FSE 和LPS 作用36 h,每孔加入10%的MTT 溶液100 μL,培養4 h 后,吸去孔內培養液。 每孔加入110 μL 二甲基亞砜,置搖床上低速震蕩10 min,使結晶物充分溶解。 490 nm 檢測各孔的吸光度。

1.3.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態

取處于對數生長期的RAW264.7 細胞接種于96 孔板,置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。 然后加入LPS 以及不同濃度FSE 作用36 h,用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態變化。

1.3.4 細胞上清液一氧化氮(NO)生成量測定

取處于對數生長期的RAW264.7 細胞密度接種于96 孔板。 藥物處理36 h 后,取各組細胞上清液50 μL 分別加入Griess Reagent I 和Griess Reagent II 液各50 μL,酶標儀540 nm 檢測各組的吸光度。

1.3.5 細胞內活性氧(ROS)和細胞凋亡測定

將對數生長期的RAW264.7 細胞,接種于6 孔板中,藥物處理完成后,加入1 mL 稀釋好的DCFHDA 或Hoechst33342 溶液,稀釋比例為1 ∶1000,使其終濃度為10 μmol/L,置于37℃細胞培養箱內避光孵育30 min,用無血清培養基洗3 次,熒光顯微鏡觀察細胞形態并拍照,用Image-Pro Plus 分析熒光強度。

1.3.6 總RNA 的提取、mRNA 的逆轉錄及Realtime PCR

提取RNA 方法參照試劑盒說明書進行,得到RNA 溶液。 按照逆轉錄試劑盒,以逆轉錄cDNA 第一鏈合成,然后以cDNA 為模板擴增目標基因的基因編碼段,以鼠GAPDH 為內參照,應用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。 擴增條件如下:95℃預變性1 min;95℃變性20 s,60℃延伸1 min,40 個循環。本實驗所用引物由北京擎科生物科技有限公司從NCBI 中獲得,引物用 Primer 6 和 Oligo 7 設計,并由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析,結果以平均數±標準差 (±s) 表示,2 組間差異比較采用t檢驗,多組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05 為具有顯著性差異,P<0.01 為具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 FSE 和LPS 對細胞活性的影響

實驗結果顯示,相比于對照組細胞,100、200 μg/mL 濃度的FSE 細胞活力分別為(67.13 ±3.25)%、(41.49±2.78)%,FSE 濃度依賴性的抑制細胞增殖,在 FSE 低于50 μg/mL 的濃度處理下,FSE 對細胞的增殖沒有明顯的抑制作用,細胞存活率沒有顯著性變化,故選用低于50 μg/mL 濃度范圍進行后續實驗(圖1A)。 相比于對照組細胞,LPS濃度在100~1500 ng/mL 均對細胞的增殖沒有明顯的抑制作用(圖1B)。

2.2 FSE 降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO產生

為研究FSE 對LPS 刺激RAW264.7 細胞后的NO 生成的影響,用不同濃度的LPS 刺激細胞36 h。結果發現,與對照組相比,在500 ng/mL 的LPS 刺激細胞時,NO 生成量最大,隨著LPS 濃度的增高,NO 生成量逐漸下降(圖2A),故后續實驗采用500 ng/mL 的LPS 作為誘導濃度。 在500 ng/mL 的LPS刺激下,研究了FSE 對細胞NO 生成量的作用。 結果發現6.25、12.5、25、50 μg/mL 濃度的FSE 可以降低LPS 刺激后細胞內NO 生成量(圖2B)。

2.3 FSE 對LPS 誘導后RAW264.7 細胞形態的影響

倒置顯微鏡下觀察到細胞生長狀態,正常組的細胞是不規則的圓形;LPS 組的細胞形態相對于正常細胞較大,長出不規則觸角,變成梭形,細胞明顯誘導貼壁;各給藥組細胞形態均趨于正常,有部分細胞恢復為半貼壁的圓形細胞(圖3)。

圖3 FSE 對LPS 誘導后RAW264.7 細胞形態的影響Figure 3 Effect of FSE on the morphology of RAW264.7 cells induced by LPS

2.4 FSE 對LPS 誘導的細胞內ROS 的影響

首先,在熒光顯微鏡下分別測得在3、6、12、24 h的綠色熒光強度。 在500 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細胞3~6 h 時,熒光強度與對照組比明顯升高,但LPS 刺激細胞24 h 時,熒光強度與對照組相比明顯減少(圖4A)。 再用12.5、25、50 μg/mL的FSE 作用細胞24 h,與LPS 組相比,FSE 組熒光強度明顯升高(圖4B、4C)。

2.5 FSE 對LPS 誘導的細胞凋亡的影響

為得到LPS 刺激之后RAW264.7 細胞的凋亡情況,在Hoechst33342 染色的3、6、12、24 h 分別在熒光顯微鏡下的藍色熒光強度。 結果發現,在24 h熒光強度差異最為明顯(圖5A)。 接下來,用12.5、25、50 μg/mL 的FSE 作用24 h,與模型組相比,FSE組熒光強度明顯下降(圖5B、5C)。

注:A:FSE 對RAW264.7 細胞活性的影響;B:LPS 對RAW264.7 細胞活性的影響。 與對照組相比, ###P<0.001。圖1 FSE 和LPS 對RAW264.7 細胞活性的影響Note.A, Effect of FSE on the activity of RAW 264.7 cells.B, Effect of LPS on the activity of RAW 264.7 cells.Compared with the control group, ###P<0.001Figure 1 Effects of FSE and LPS on the activity of RAW 264.7 cells

注:A:不同濃度的LPS 刺激RAW264.7 細胞后NO 生成量;B:不同濃度的FSE 對LPS 刺激后細胞NO 生成量的影響。 與對照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖2 FSE 降低LPS 刺激后NO 的產生Note.A, NO production of RAW264.7 cells stimulated by different concentrations of LPS.B, Effects of different concentrations of FSE on cell NO production stimulated by LPS.Compared with the control group, # ##P<0.001.Compared with the LPS group, ???P<0.001.Figure 2 FSE reduces NO production after LPS stimulation

注:A:不同濃度LPS 刺激RAW264.7 細胞后ROS 產生的作用時間;B、C:不同濃度的FSE 降低LPS 刺激后ROS 的產生。 與對照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖4 FSE 升高LPS 刺激后ROS 的產生Note.A, Time of ROS production after different concentrations of LPS stimulated RAW264.7 cells.B, C, Different concentrations of FSE reduce the production of ROS stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group, ???P<0.001.Figure 4 FSE reduces ROS production after LPS stimulation

注:A:不同濃度LPS 刺激RAW264.7 細胞凋亡的作用時間;B、C:不同濃度的FSE 減少LPS 刺激后的細胞凋亡。 與對照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖5 FSE 減少LPS 刺激后的細胞凋亡Note.A, Time of apoptosis of RAW264.7 cells stimulated by different concentrations of LPS.B, C, Different concentrations of FSE reduce apoptosis stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group,???P<0.001.Figure 5 FSE reduces apoptosis stimulated by LPS

2.6 LPS 誘導的RAW264.7 細胞極化的濃度和時間研究

為了研究不同LPS 濃度對RAW264.7 細胞極化的影響,分別用100、250、500、750 ng/mL 的LPS作用細胞24 h,與對照組相比,TNF-α、iNOS mRMA表達水平在不同LPS 濃度下均顯著增高;IL-6 mRMA 表達水平在100 ng/mL 和250 ng/mL 的LPS 作用下降低,在500 ng/mL 和750 ng/mL 的LPS 作用下顯著增高;IL-1β mRMA 表達水平在250 ng/mL 的LPS 下逐漸增高;IL-10 mRMA 表達水平在100 ng/mL 和250 ng/mL 的LPS 作用下顯著降低;CD206 mRMA、Arginase-1 表達水平在不同LPS 濃度下顯著降低(圖6A~6G)。

為了研究LPS 作用不同時間對RAW264.7 細胞極化的影響,在500 ng/mL 的LPS 作用細胞后,分別得到M1 表型基因(TNF-α、IL-1β、iNOS、IL-6)和M2 表型基因(IL-10、CD206、Arginase-1)不同時間點的mRNA 表達水平。 結果發現,TNF-α 和IL-1β mRMA 表達水平在6 h 時顯著增高,iNOS 和IL-6 mRMA 表達水平在36 h 時顯著增高,IL-10、CD206 mRMA 表達水平在36 h 時顯著降低,Arginase-1 mRMA 表達水平在24 h 時顯著降低(圖6H~6N)。

2.7 FSE 對LPS 誘導的細胞極化的影響

為了進一步研究FSE 對細胞極化的調節作用,將FSE 加入500 ng/mL 的LPS 刺激細胞36 h。 結果顯示,FSE 可以降低LPS 誘導上調的基因(IL-1β、IL-6、iNOS) mRNA 表達水平,同時可以升高LPS 誘導下調基因(CD206、IL-10)mRNA 表達水平(圖7)。

注:A~C:不同濃度的FSE 對LPS 刺激后的RAW264.7 細胞M1 表型的極化調節;D~E:不同濃度的FSE 對LPS 刺激后的RAW264.7細胞M2 表型的極化調節。 與對照組相比, # ##P<0.001;與LPS 組相比, ??P<0.01, ???P<0.001。圖7 不同濃度的FSE 對LPS 刺激后的細胞極化的調節Note.A~ C, Polarization regulation of FSE at different concentrations on M1 phenotype of RAW264.7 cells stimulated by LPS.D~ E, Polarization regulation of FSE at different concentrations on M2 phenotype of RAW264.7 cells stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group, ??P<0.01,???P<0.001.Figure 7 Regulation of FSE at different concentrations on cell polarization stimulated by LPS

注:A~G:500 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細胞極化的作用時間;H~N:不同濃度的LPS 刺激24 h 后RAW264.7 的細胞極化。 與對照組相比, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001。圖6 LPS 刺激RAW264.7 細胞極化的時間和濃度Note.A~G, Polarization time of RAW264.7 cells stimulated by 500 ng/mL LPS.H~N, Cell polarization of RAW264.7 after 24 hours stimulated by different concentrations of LPS.Compared with the control group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 6 Time and concentration of LPS stimulated RAW264.7 cell polarization

3 討論

炎癥反應在人體內普遍存在,參與了慢性阻塞性肺病、炎癥性腸病、神經退行性疾病、心血管疾病、消化性疾病以及糖尿病等多種疾病的發生發展[9-10]。 這些炎癥性疾病給社會帶來了相當大的經濟負擔,縮短了患者的平均預期壽命[11-12], 目前,非甾體抗炎藥作為抑制炎癥癥狀的常用藥物,長期使用會產生胃腸道等各種副作用[13],因此,迫切需要研究可靠、有效的替代藥物來預防和治療各種疾病。

連翹作為傳統中藥,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、神經系統保護等諸多作用。 具有較大的臨床藥用價值,現已分離出300 多種化學成分,包括苯乙醇苷類、木脂素類、酚酸類、黃酮類、萜類及揮發油、C6-C2天然醇及其苷類等[14],其中主要化學成分為苯乙醇苷類和木脂素類[15],目前分離得到苯乙醇苷類成分包括連翹酯苷A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、毛柳苷、車前草苷A、木通苯乙醇苷A、B 等[16-17]。木脂素類成分主要包括連翹苷、連翹脂素、牛蒡子苷元、松脂素、表松脂素、落葉松脂素、異落葉松脂素、Cedrusin、連翹蘭A、連翹蘭B、異橄欖脂素[18],其中連翹酯苷A 和連翹苷為2020 版《中國藥典》連翹含量測定的指標性成分[19]。 連翹提取物均有抑制炎癥反應的作用,其水提物、甲醇提取物、乙醇提取物以及揮發油等可以抑制多種炎癥模型[20-23],連翹各極性部位提取物的含量差別較大,其中水提取物提取率最高[24],連翹提取物主要通過NF-κB 信號通路、JAK/STAT 信號通路、MAPK 信號通路,調控炎癥過程中的多種酶及炎性介質的產生[25],從而抑制炎癥反應。

活性氧(ROS)作為體內炎癥反應的重要活性成分,主要由NADPH 氧化酶(Nox)產生,通過激活下游信號級聯反應來擴大炎癥的二級信使[26-27],ROS 也可以過激活非特異性免疫系統消除病原體和修復損傷組織[28],研究發現LPS 可以促進ROS的產生[29],本研究中,LPS 在刺激RAW264.7 細胞后3~6 h 時,細胞內ROS 大量產生,但是在LPS 刺激細胞24 h 時,細胞內ROS 產生減少,而FSE 可以增加LPS 刺激24 h 時的ROS 產生。

此外,ROS 通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途徑觸發多種細胞內反應[29],調節細胞的凋亡過程[30]。 ROS 對巨噬細胞發揮雙向調節作用,ROS 既可以促進巨噬細胞的凋亡,又可以抑制巨噬細胞的凋亡,這可能與cAMP 激活 cAMP 依賴性蛋白激酶有關[31]。 在LPS 誘導24 h 時,ROS 的產生量顯著減少,RAW264.7 細胞凋亡顯著增加。 FSE 可以增加LPS 刺激24 h 時的ROS 產生量,并且減少LPS刺激24 h 時的細胞凋亡,FSE 發揮抗炎作用可能是通過增加巨噬細胞內的ROS,抑制其自身細胞的凋亡,進而發揮巨噬細胞的免疫調節功能。

近年來,巨噬細胞的極化參與多種疾病過程的調節,如免疫性神經炎[32]、炎癥性腸病[33]、糖尿病和肥胖癥[34]、類風濕性關節炎[35]等,巨噬細胞的極化可以通過LPS 誘導為M1 型或者通過IL-4 誘導為M2 型巨噬細胞[36-37],本文研究了LPS 誘導的RAW264.7 細胞極化的模型,在不同濃度的LPS 以及LPS 作用不同時間中,M1 和M2 表型的基因表達水平存在差異,為RAW264.7 細胞極化的模型提供了新思路。 進一步研究發現FSE 可顯著降低LPS誘導RAW264.7 細胞M1 表型IL-1β、iNOS、IL-6 mRNA 表達水平,FSE 同時明顯升高M2 表型CD206、IL-10 mRNA 表達水平,以發揮抗炎的作用。

綜上所述,FSE 可通過抑制RAW264.7 細胞的凋亡以及促進M2 型巨噬細胞的表達,從而抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥反應,從細胞凋亡和巨噬細胞極化功能角度進一步闡明連翹發揮抗炎作用的內在機制,對其臨床應用提供了很好的參考。