真武湯對心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及PI3K-AKT通路的影響

王 興陳子琪李 林廖金花王曉琳劉江源廖東華?

(1.江西中醫藥大學, 南昌 330000;2.江西中醫藥大學附屬醫院, 南昌 330006)

心力衰竭(heart failure,HF)是多種原因導致心臟結構和/或功能的異常改變,使心室收縮和/或舒張功能發生障礙,從而引起的一組復雜臨床綜合征,是各種心臟疾病的嚴重表現和晚期階段,是心臟病患者死亡的主要原因。 目前我國約有850 萬HF 患者,患病率逐年上升,再住院率日趨上漲,死亡率居高不下[1-2]。 中醫學認為溫陽益氣,化痰利水為治療此病的主要法則[3],真武湯源于《傷寒論》,由附子、生姜、白芍、白術、茯苓組成,為溫陽利水,標本兼治的代表性方劑,臨床應用廣泛。 為了進一步探究真武湯治療HF 的機制,本研究通過構建冠脈結扎心衰大鼠模型,觀察真武湯對冠脈結扎心衰大鼠模型的治療作用及對心衰大鼠心肌病理形態學及心肌細胞凋亡的影響,探討其對凋亡相關蛋白及PI3K-AKT 信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6~7 周齡,SPF 級SD 大鼠,雄性,共48 只,體重220~250 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],動物飼養于江西中醫藥大學實驗動物科技中心[SYXK(贛)2017-0004],將它們安置在恒定的室溫(25±1)℃,相對濕度(55±3)%。 12 h/12 h 晝夜循環,動物自由進食飲水。 實驗動物使用經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(JZLLSC20210059),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

真武湯顆粒劑(組成:附子,白芍,白術,茯苓,生姜,江西中醫藥大學附屬醫院提供,全方生藥量62 g);氯沙坦鉀片(浙江華海藥業股份有限公司,0000005951)。

PI3 Kinase p110α(C73F8)Rabbit mAb(美國CST 公司,#4249);Anti-AKT1 antibody[ST48-09](杭州華安生物,ET1609-47);Phospho-Akt1(S124)antibody(杭州華安生物,ET1701-36);Bcl-2 抗體( abcam, ab32124 ); Caspase3 抗 體 ( abcam,ab13847);Bax 抗體(abcam,ab32503);Caspase8 抗體(華安生物,RT1099);Caspase9 抗體(abcam,ab184786);二抗goat anti-rabbit IgG-HRP(愛必信生物,abs20040);ELISA 試劑盒(江蘇酶免實業有限公司,MM-0067R1);DAB 濃縮型試劑盒(北京索萊寶,DA1010 ); Tunel 試 劑 盒 ( Roche 公 司,11684817910)。

正置顯微鏡(徠卡顯微系統有限公司);恒溫烘箱(上海一恒科學儀器有限公司);石蠟切片機(徠克公司); 攤片機(徠克公司); 冰凍切片機(thermo);脫水機(武漢俊杰電子有限公司);包埋機(武漢俊杰電子有限公司);Western blot 系統(美國Bio-Rad);Bio-Rad 凝膠成像系統(美國Bio-Rad);高通量組織研磨器(寧波新芝生物);離心機(湖南湘儀);酶標儀(BioTek 儀器);DW3000 型小動物人工呼吸機(安徽正華儀器設備有限公司);MD3000 型生理信號采集系統(淮北正華儀器設備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法

造模方法參考文獻[4],實驗前禁食12 h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉后將其固定在鼠板上,行經口氣管插管術后接小動物呼吸機,調頻率為80 次/分,吸呼比1 ∶2,潮氣量4.5 L。連接心電圖機,測量術前心電圖。 沿著胸骨左緣約3 mm 縱行剪開胸部皮膚4 cm,逐層鈍性分離皮下、肌肉,暴露肋骨及肋間肌,在第三肋間剪開肋間肌,利用自制的開胸器撐開肋骨,開胸后撕破心包膜,暴露心臟,于肺動脈圓錐及左心耳交界處下方2 mm處用6-0 縫線結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending artery,LAD),結扎后關胸,逐層縫合肌肉皮膚,測量術后心電圖,心電圖提示ST 段升高則造模成功。 測量心電圖后拔出氣管插管,術后每天每千克予青霉素24 萬單位,共5 d,預防感染。 假手術組大鼠開胸后立即縫合。

1.3.2 實驗分組

術后4 周采用隨機數字表法將存活的大鼠分為6 組,每組7 只,分組如下:(1)假手術組:術后4 周給予生理鹽水灌胃28 d;(2)模型組:造模4 周后予生理鹽水灌胃28 d;(3)陽性對照組:造模4 周后予氯沙坦鉀5 mg/kg 灌胃28 d;(4)真武湯低劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量6 g/kg 灌胃28 d;(5)真武湯中劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量12 g/kg 灌胃28 d;(6)真武湯高劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量18 g/kg 灌胃28 d。

1.3.3 心臟彩超測定

本實驗小動物超聲影像系統Vevo2100 型由江西中醫藥大學動物科技中心實驗室提供。 用異氟烷吸入麻醉,應用MS250 超聲探頭進行心臟超聲影像分析。 測量射血分數(LVEF);短軸縮短率(LVFS%)。

1.3.4 樣本制備及計算左心室質量指數(LVMI)

取材前稱體重,大鼠麻醉后,于腹主動脈取血,靜置離心后分離血清,置于-80℃冰箱以備ELISA檢測。 開胸取心臟,冰生理鹽水洗凈,濾紙吸干,沿房室溝剪掉兩心房,剪掉主、肺動脈,緊貼室間隔右側剪下右心室游離壁,剩余部分即為左心室。 稱取左心室質量腹主動脈取血分離血清,計算左心室質量/體重,即LVMI。 在結扎部位以下處經橫斷面切取心肌組織置于4%多聚甲醛固定。 剩余左室心肌梗死邊緣組織放入凍存管內,置于液氮中冷凍保存以備蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測。 LVMI=大鼠左心室質量/大鼠體重。

1.3.5 心臟組織HE 染色

心肌組織固定后常規包埋切片,脫蠟,常規HE染色,封片,顯微鏡下觀察病理改變。

1.3.6 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡水平

將蠟塊切成厚度為5 μm 的切片,脫蠟后進行TUNEL 染色。 中性樹膠封片,顯微鏡下觀察切片中心肌細胞的凋亡水平。

1.3.7 免疫組織化學染色法:

免疫組化染色步驟參照試劑盒說明書進行。檢測心肌凋亡代表性蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase8、Caspase9,顯微鏡400 倍視野下隨機采取5個視野,應用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行結果分析。

1.3.8 ELISA 測定

按照說明書操作步驟進行檢測大鼠血清中BNP 的含量。

1.3.9 Western blot 檢測蛋白表達

取20 μg 各組左室心肌勻漿蛋白樣品,用SDSPAGE 分離,然后轉至PVDF 膜上,于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h;將PVDF 膜與相應的一抗在4℃下孵育過夜,洗膜后二抗孵育(37℃,1 h),再次洗膜后發光并使用Image Lab 軟件分析結果。 目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件,進行多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統計,組間兩兩比較用方差分析后的LSD 檢驗。 實驗數據以平均數±標準差(±s)表示,以P<0.05 為具有統計學意義。 實驗圖采用GraphPad Prism8 軟件繪制。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及心電圖表現

大鼠造模后心電圖可見明顯ST 段抬高,提示造模成功(圖1)。 術后喂養4 周,模型組大鼠可見精神萎靡、活動量減少、四肢及尾部稍有浮腫,各給藥組和模型對照組比較精神狀態較好,活動較自如,四肢及尾部浮腫減輕。

圖1 大鼠心電圖Figure 1 Rat ECG

2.2 對大鼠心臟形態學指標的影響

如表1 所示,與假手術組相比,模型組大鼠LVMI 值顯著升高(P<0.01),提示模型組出現明顯的左室肥厚。 LVEF 值和LVFS 值顯著下降(P<0.01),側面證明大鼠造模成功。 與模型組比較,各給藥組LVMI 值均顯著降低(P<0.01),其中中藥中劑量組效果最優,且優于陽性藥組;各給藥組LVEF值、LVFS 值均較模型組升高,其中中藥中劑量組顯著升高(P<0.01),中藥低、高劑量組升高明顯(P<0.05),陽性藥組無統計學意義(P>0.05)。 各組大鼠彩超圖見圖2。

圖2 各組大鼠心臟彩超圖Figure 2 Color Doppler echocardiography of rats in each group

表1 心臟形態學指標Table 1 Cardiac morphological indexes

2.3 對大鼠HE 染色的影響

相較于假手術組,模型組心肌纖維排列紊亂、斷裂,同時并伴隨著心肌細胞腫脹、肥大,有炎性細胞浸潤,與模型組比較,真武湯低、中、高劑量組及陽性藥組心肌細胞腫脹、炎性細胞浸潤存在不同程度的減輕,心肌纖維纖維排列較模型組整齊(圖3)。

圖3 各組大鼠HE 染色圖Figure 3 HE staining diagram of rats in each group

2.4 TUNEL 染色觀察各組大鼠心肌組織中心肌細胞凋亡水平比較

如圖4 所示,可見凋亡細胞核被染成棕黃色,正常細胞核呈藍色。 與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織中形態不規則,大小不一致的心肌細胞核明顯增多,提示心肌細胞凋亡情況嚴重,與模型組比較,真武湯低、中、高及陽性藥對照組形態和大小正常的藍色細胞核明顯增多,提示經真武湯或氯沙坦鉀干預后凋亡現象改善。

圖4 各組大鼠TUNEL 染色Figure 4 TUNEL staining of rats in each group

2.5 心 衰 心 肌 組 織 中 Bcl-2、 Bax、 Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達差異

如表2 所示,與假手術組比較,模型組Bcl-2表 達 顯 著 下 降(P< 0.01), Bax、 Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達顯著升高(P<0.01)。 與模型組相比,低劑量組Bcl-2 表達增強(P<0.05),中、高劑量組及陽性對照組增強顯著(P<0.01)。 真武湯低、中、高劑量組及陽性藥對照組Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 蛋白表達降低,差異均有統計學意義(P<0.01 或P<0.05)。 其中中藥中劑量組Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 蛋白表達與假手術無明顯差異,提示真武湯可有效抑制心衰大鼠過度凋亡,中劑量真武湯抗凋亡效果最佳。

表2 免疫組化分析結果(IOD/area)Table 2 Results of immunohistochemical analysis (IOD/area)

2.6 對大鼠BNP 水平和PI3K、AKT1、p-AKT1 表達的影響

相比于假手術組,模型組BNP 水平顯著升高(P<0.01),其余各組較模型組不同程度下降(P<0.01),中藥中劑量下降最為顯著(P<0.01)。 結果提示心衰大鼠模型造模成功,真武湯及氯沙坦均能有效降低大鼠BNP 水平,以中劑量效果最為顯著(圖5A)。

與假手術組相比,模型組PI3K、p-AKT1、AKT1表達均升高,與模型組比較,真武湯低、中、高劑量組PI3K、AKT1、p-AKT1 表達均下降,差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01),且真武湯各劑量組PI3K、p-AKT1、AKT1 表達水平與假手術組無明顯差異(P>0.05)(圖5B~5E)。

注:與假手術組相比, ##P<0.05, ####P<0.01;與模型組相比,??P<0.05,????P<0.01;與陽性對照組相比,&&P<0.05,&&&&P<0.01。圖5 各組大鼠BNP 水平和Western blot 結果Note.Compared with the sham operation group, ##P<0.05, ####P<0.01.Compared with the model group, ??P<0.05,????P<0.01.Compared with the positive control group,&&P<0.05,&&&&P< 0.01.Figure 5 BNP level and Western blot results of rats in each group

3 討論

從中醫學角度討論,心衰多見本虛重而標實亦重、虛實夾雜,互相裹挾之癥,以心氣心陽虛憊為本,水飲、瘀血、痰濁乃標實之候[5]。 心氣心陽虛衰,推動和溫煦的功能疲憊,進而導致血瘀的病理狀態,瘀血阻滯,血不利則為水,隨著病情遷延,虛實互為因果,水飲、痰濁、瘀血為盛,陰勝則陽病,繼而加重心陽之虛衰,心臟之虛累及五臟,致使心、腎、脾陽衰憊,無力行水化氣,而致水飲內停,飲停于內,或射肺,或凌心,或溢于肌膚,臨床所見則為喘、為悸、為腫[5-7]。 故而心衰病證的病機關鍵是陽虛水泛,溫陽益氣,化痰利水為治療此病的主要法則[8-9]。

真武湯為溫陽利水代表方,臨床研究已證實,真武湯治療HF 通過改善心臟射血分數(LVEF)、每搏輸出量(SV)、心搏量指數(SVI)、心臟指數(CI)等從而減輕臨床癥狀[10-11]。

本研究選用結扎大鼠冠狀動脈左前降支法構建HF 模型, 此方法與臨床上由冠狀動脈阻塞所引起的心肌梗死的病理特征相符,是較理想的構建HF動物模型的方法,也是目前研究HF 常用的動物模型之一[12-13]。 在模型組中,大鼠出現明顯的左室肥厚,LVEF<50%,HF 標志物BNP 水平明顯上升(P<0.01),判斷心衰模型建立成功[1,14]。

實驗結果表明,真武湯能明顯改善HF 大鼠LVEF、LVFS、LVMI,增強HF 大鼠心肌收縮力,緩解HF 大鼠左室肥厚程度。 病理結果顯示心衰大鼠心肌細胞明顯腫脹、肥大及炎性細胞浸潤,改善HF 大鼠心肌纖維化,并能有效降低心衰大鼠血清BNP 水平,抑制心衰大鼠心肌細胞過度凋亡。 在真武湯各劑量組比較中,真武湯中劑量組各方面表現均優于低、高劑量組。 另外,有研究指出真武湯方中君藥附子的毒效網絡具有極高的相似性,其強心作用也是其心臟毒性的原因[15]。 以上提示真武湯干預HF可能在某一劑量區域內存在正向的量效關系,且與方中附子的劑量有關。

心肌細胞凋亡是心肌細胞丟失的主要原因,在心室重塑和隨后的HF 過程中起著關鍵作用。 細胞的凋亡主要包括死亡受體介導和線粒體介導兩種途徑,死亡受體介導途徑通過形成死亡誘導信號復合物(DISC)激活Caspase8,進而發生級聯反應活化Caspase3 等導致凋亡事件。 線粒體介導途徑通過影響線粒體膜通透性,促使線粒體內凋亡啟動因子釋放至胞質形成凋亡復合體(apoptosome),激活Caspase9,進而通過級聯反應激活Caspase3 等發生凋亡。 Caspase8 和Caspase9 的激活是這兩種途徑最關鍵的過程[16]。 Bcl-2 家族的抗凋亡和促凋亡成員與線粒體凋亡通路密切相關。 Bcl-2 和Bax 是一組典型的抗凋亡蛋白和促凋亡分子,它們作用于線粒體外膜,導致凋亡啟動因子的釋放[17]。 PI3K/AKT 信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路,過往研究認為短期激活PI3K/AKT 可抑制細胞凋亡因子,增強血管生成,調節Ca2+內流,促進心肌細胞能量的代謝以及抑制炎癥反應的進行等過程促進生理性肥厚,保護心肌免受損傷,而長期激活則可引起病理性肥厚和心力衰竭[18]。

本研究發現HF 大鼠PI3K、p-AKT1、AKT1 表達顯著 升 高, 同 時 伴 有Bax、 Caspase3、 Caspase8、Caspase9 表達上升,Bcl-2 表達降低,而真武湯可顯著降低Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達,提高Bcl-2 表達水平,PI3K、p-AKT1、AKT1 表達水平下降。 提示真武湯可能通過調控PI3K-AKT 通路,抑制凋亡相關蛋白表達,進而改善心室重構,增強心肌收縮力,延緩心衰進程。