miR-30b 在高磷誘導的血管平滑肌細胞凋亡中的作用

劉 蘭張東雪張勝雷白亞玲

(河北醫科大學第四醫院 腎內科,石家莊 050011)

血管鈣化能夠增加心臟病、動脈粥樣硬化斑塊破裂、腦卒中的風險,是增加心血管疾病發病率和死亡率的重要危險因素[1-2]。 血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡是血管鈣化的重要機制之一[3]。 此外,研究發現[4],miRNAs在細胞成骨轉化、細胞轉移及細胞凋亡中起重要作用。 miR-30b 是miR-30 家族的一員[5],在人體組織中廣泛表達,且已有報道顯示,miR-30b 能夠靶向調控人主動脈瓣瓣膜間質細胞的鈣化[6]。 但miR-30b在血管平滑肌細胞凋亡中的作用機制尚不明確。因此,本研究對大鼠VSMCs 進行體外培養,在高磷環境中探討miR-30b 參與調節大鼠血管平滑肌細胞凋亡的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取SPF 級雄性健康SD 大鼠6 只,4 周齡,體重約80~100 g,由河北醫科大學實驗動物中心提供[SCXK(冀)2020-002],合格證編號:1305090。 將實驗動物飼養于河北醫科大學第四醫院實驗動物中心[SYXK(冀)2018-001],環境溫度18℃~24℃,濕度40%~60%,12 h/12 h 明/暗循環環境,飼料、飲水均經過高壓滅菌處理。 本研究已通過河北醫科大學第四醫院倫理委員會審核(2021KY044),所有動物實驗操作均在3R 原則的指導下給與實驗動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養液(批號:31600-034)(美國Gibco公司); 胎牛血清(批號: A0500-3210) (美國Cegrogen 公司);β-甘油磷酸(批號:SLCD0875)(美國Sigma 公司);RNA 反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR 試劑盒(批號:R11068.5)(銳博生物公司);miR-30b 的抑制物(批號:R11035.4)(銳博生物公司); GAPDH 抗 體( 批 號: AP0063) ( 美 國Proteintech,公司);BAX 抗體(批號:50599-2-Ig)(美國Proteintech 公司);Bcl-2 抗體(批號:AF6139)(美國Affinity 公司);山羊抗兔二抗(批號:5220-0336)(美國Seracare 公司)。

實時熒光定量PCR 儀(批號:QuantStudio DX)(美國life 公司);倒置相差顯微鏡(批號:Axio Observer D1)(日本OLYMPUS 公司);細胞培養箱(批號:150i)(美國Sheldon 公司);酶標儀(批號:CytationⅢ (美國Biotek 公司);蛋白電泳儀(批號:10025025 Rev A 12-0625 0312)(美國BIO-RAD 公司); 凝膠成像系統(批號: FR0146) (美國Proteinsimple 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗模型的制備與分組

對實驗大鼠進行稱重,根據體重腹腔注射200 mg/kg 的戊巴比妥鈉進行麻醉,75%乙醇溶液浸泡消毒10 min 后,經腹部中線縱行切口,依次分離進入胸腔,取大鼠胸主動脈,分離中膜層,剪成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊,均勻鋪于瓶底,組織貼壁法對VSMCs 行原代培養。 貼壁細胞占底壁的80%~90%時進行傳代,使用PBS 液沖洗2 次,胰酶消化1 min,加入等量完全培養基,吹打混勻,收集細胞并離心后,按1 ∶2 進行傳代培養。 傳代至第3~4 代將細胞分為兩組:正常組和高磷組(給予10 mmol/L β-甘油磷酸鹽),干預7 d 后檢測miR-30b、BAX、Bcl-2等指標的變化。 為進一步驗證miR-30b 對VSMCs的作用,給予轉染miR-30b 的抑制物inhibitor-30b,將細胞分為3 組:(1)正常組:細胞未轉染;(2)inhibitor-NC 組:轉染20 μmol/L 抑制物的對照inhibitor-NC 5 μL;(3) inhibitor-30b 組: 轉 染20 μmol/L 抑制物inhibitor-30b 2.5 μL。 轉染72 h 后檢測凋亡情況。 為進一步驗證高磷環境中miR-30b的作用,給予轉染miR-30b 的類似物mimic-30b,將細胞分為3 組:(1)高磷組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養,細胞未轉染;(2)高磷+mimic-NC 組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養,轉染20 μmol/L 類似物的對照mimic-NC 5 μL;(3)高磷+mimic-30b 組:10 mmol/L β-甘油磷酸鹽培養,轉染20 μmol/L 類似物mimic-30b 5 μL。 轉染72 h 后檢測凋亡情況。

1.3.2 細胞SM22α 免疫組化染色

取出細胞用4%的中性福爾馬林固定30 min,PBS 洗3 次,0.3% Triton-100,作用20 min,PBS 洗3次,H2O2作用15 min,PBS 洗3 次,加入5%山羊清封閉在37℃孵育30 min,加入SM22α 一抗4℃過夜,次日,PBS 洗3 次,加入二抗A 液,作用30 min,PBS 洗3 次,加入二抗B 液,作用30 min,PBS 洗3次,加入DAB 顯色液作用30 s,自來水洗3 次,蘇木素復染,脫水封片。

1.3.3 MTT 法檢測細胞增殖能力

接種于96 孔板中的血管平滑肌細胞融合達60%~70%給予刺激,每組設3 個復孔。 取MTT(5 mg/mL)各檢測孔加入20 μL,培養箱中培養4 h,棄去培養液,取二甲基亞砜各檢測孔加入150 μL,于室溫振蕩10 min。 酶標儀490 nm 波長處測定吸光度(A)值,記錄結果。

1.3.4 流式細胞法檢測細胞的凋亡

給予刺激后,收集細胞,根據試劑說明書進行Annexin V-PE/7-AAD 雙重染色,流式細胞儀檢測,右上象限Annexin V 為陽性、7-AAD 為陽性,為晚期凋亡細胞;右下象限Annexin V 為陽性、7-AAD 為陰性,為早期凋亡細胞。 實驗重復3 次。

1.3.5 實時熒光定量PCR 檢測各組miR-30b 表達

分別提取各組的miR-30b。 實驗均重復3 次。銳博生物提供的miR-30b 和U6 的引物,U6 為內參,反應條件為:預變性95℃ 10 min;變性95℃ 10 s、退火60℃ 20 s,40 個循環,重復3 次。

1.3.6 Western blot 檢測Bcl-2、BAX 蛋白的表達

提取各組VSMCs 的蛋白質,配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠(10%),加樣20 μg 蛋白質,進行電泳1.5 h(95 V 恒壓)。 后轉膜1 h(恒壓95 V),洗膜3 次,牛清(5%)封閉1 h。 加入一抗稀釋液(BAX 1 ∶2000,Bcl-2 1 ∶1000,GAPDH 1 ∶5000),4℃孵育過夜,次日加二抗稀釋液(1 ∶5000),37℃孵育1 h。使用蛋白成像系統照膜,實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0 統計學軟件進行統計學處理,正態分布的計量資料結果用平均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高磷對VSMCs 增殖凋亡的影響

2.1.1 VSMCs 的原代培養及細胞鑒定

VSMCs 原代培養第3 天,即有血管平滑肌細胞從組織塊周圍爬出,長至第7 天,組織塊周圍的細胞相互融合在一起,平行排列、呈束狀,部分重疊在一起,呈“峰-谷”狀生長。 單個細胞呈梭形、不規則形,以梭形為主,細胞核為卵圓形。 細胞SM22α 免疫組化染色可見細胞漿內呈棕黃色,胞質內的肌動蛋白被染成棕黃色,呈絲狀沿細胞長軸平行分布細胞核為藍色,SM22α 染色為陽性,表明細胞為血管平滑肌細胞,見圖1。

注:A:原代培養第3 天的組織塊及爬出的血管平滑肌細胞;B:原代培養第7 天的組織塊及爬出的血管平滑肌細胞;C:血管平滑肌細胞SM22α 的免疫組化染色,呈棕黃色為陽性。圖1 VSMCs 的原代培養及細胞鑒定Note.A, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 3rd day of primary culture.B, Tissue block and crawled vascular smooth muscle cells on the 7th day of primary culture.C, Immunohistochemical staining of SM22α, a vascular smooth muscle cell, was brown and positive.Figure 1 Primary culture and cell identification of VSMCs

2.1.2 高磷對大鼠VSMCs 凋亡的影響

流式細胞儀結果顯示,與正常組比較,高磷組細胞凋亡顯著增多(t=-12.841,P<0.001),有統計學差異(P<0.05),見圖2。

2.1.3 高磷對大鼠VSMCs 增殖的影響

MTT 結果顯示:與正常組比較,高磷組細胞增殖能力于12、24、36、48 h 均顯著降低(P<0.05)。高磷組與正常組比較,0、12、24、36、48 h 分別為(t=0.105,P=0.921,t=13.03,P<0.001,t=16.892,P<0.001,t=12.659,P<0.001,t=18.049,P<0.001),有統計學差異(P<0.05),見圖3。

2.1.4 高磷對BAX、Bcl-2 表達的影響

Western blot 結果顯示,高磷組VSMCs 促凋亡基因BAX 上調(t=-4.727,P=0.009)、抑凋亡基因Bcl-2 的表達明顯下降(t=-14.872,P<0.001),有統計學差異(P<0.05),見圖4。

2.2 高磷對大鼠VSMCs miR-30b 表達的影響

實時熒光定量PCR 結果顯示,與正常組比較,高磷組VSMCs miR-30b 的表達明顯下降(1.00±0.00 vs 0.387±0.05,t=19.497,P<0.05),有統計學差異(P<0.05),提示高磷能夠抑制miR-30b 的表達,見圖5。

注:A:正常組與高磷組的流式結果;B:正常組與高磷組凋亡細胞百分比。 與正常組相比,???P<0.001。 圖2 兩組血管平滑肌細胞的凋亡情況(n=3)Note.A, Flow results of normal group and high phosphorus group.B, Percentage of apoptotic cells in normal group and high phosphorus group.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 2 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in two groups

注:A:各組細胞的MTT 結果;B:各組細胞不同時間段的顯微鏡下照片。 與正常組相比,???P<0.001。圖3 兩組血管平滑肌細胞的增殖情況(n=3)Note.A, MTT results of cells in each group.B, Microscopic photos of cells in each group at different time periods.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 3 Proliferation of vascular smooth muscle cells in two groups

2.3 miR-30b 對VSMCs 增殖凋亡的影響

2.3.1 miR-30b 低表達對VSMCs 凋亡的影響

流式結果顯示,與正常組比較,inhibitor-30b 組VSMCs 凋亡增多(P<0.001),與inhibitor-NC 組比較,inhibitor-30b 組VSMCs 凋亡增多(P<0.001)有統計學差異(P<0.05),提示miR-30b 低表達能夠促進VSMCs 凋亡,見圖6。

2.3.2 miR-30b 低表達對VSMCs 增殖的影響

MTT 結果顯示:與正常組和inhibitor-NC 組比較,inhibitor-30b 組細胞增殖能力于12、24、36、48 h均顯著降低(P<0.05)。 正常組和inhibitor-NC 組比較,無統計學差異(P>0.05)。 見圖7。

注:與正常組相比,??P<0.01,???P<0.001。圖4 兩組血管平滑肌細胞相關蛋白表達情況(n=3)Note.Compared with normal group, ??P<0.01,???P<0.001.Figure 4 Expression of vascular smooth muscle cells related proteins in two groups

注:與正常組相比,???P<0.001。圖5 兩組血管平滑肌細胞的miR-30b 的表達(n=3)Note.Compared with normal group,???P<0.001.Figure 5 Expression of miR-30b in vascular smooth muscle cells of the two groups

注:與正常組相比,???P<0.001;與inhibitor-NC 組相比, ###P<0.001。圖6 各組血管平滑肌細胞的凋亡情況(n=3)Note.Compared with normal group,???P<0.001.Compared with inhibitor-NC group, ###P<0.001.Figure 6 Apoptosis of vascular smooth muscle cells in each groups

2.3.3 miR-30b 低表達對BAX、Bcl-2 表達的影響

Western blot 印跡結果結果顯示,inhibitor-30b組VSMCs 促凋亡基因BAX 上調(P< 0.01)、抑凋亡基因Bcl-2 的表達明顯下降(P<0.01),有統計學差異(P<0.05),見圖8。

2.3.4 miR-30b 高表達對VSMCs 凋亡的影響

流式結果顯示,與高磷組比較,高磷-mimic-30b組VSMCs 凋亡減少(P<0.01),與高磷-mimic-NC 組比較,高磷-mimic-30b 組VSMCs 凋亡減少(P<0.01),有統計學差異(P<0.05),提示miR-30b 高表達能夠抑制VSMCs 凋亡,見圖9。

2.3.5 miR-30b 高表達對BAX、Bcl-2 表達的影響

Western blot 印跡結果顯示,與高磷組和高磷-mimic-NC 組比較,高磷-mimic-30b 組VSMCs 促凋亡基因BAX 下調、抑凋亡基因Bcl-2 的表達明顯上調,有統計學差異(P<0.05),見圖10。

注:與正常組相比, ?P<0.05;與inhibitor-NC 組相較, #P<0.05。圖7 各組血管平滑肌細胞的增殖情況Note.Compared with normal group, ?P < 0.05.Compared with inhibitor-NC group, #P<0.05.Figure 7 Proliferation of vascular smooth muscle cells in each groups

注:a:正常組;b:inhibitor-NC 組;c:inhibitor-30b 組。 與正常組相比,??P<0.01;與inhibitor-NC 組比較, ##P<0.01。圖8 各組血管平滑肌細胞相關蛋白表達情況(n=3)Note.a, Normal group.b, Inhibitor-NC group.c, Inhibitor-30b group.Compared with normal group, ??P<0.01.Compared with inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 8 Expression of vascular smooth muscle cell related proteins in each groups

注:與高磷組相比,??P<0.01;與高磷-mimic-NC 組相比, ##P<0.01。圖9 miR-30b 高表達對血管平滑肌細胞凋亡的影響(n=3)Note.Compared with High phosphorus group group, ??P<0.01.Compared with High phosphorus-mimic-NC group, ??P<0.01.Figure 9 Effect of miR-30b overexpression on apoptosis of vascular smooth muscle cells

注:a:高磷組;b:高磷-mimic-NC 組;c:高磷-mimic-30b 組。 與高磷組相比, ?P<0.05;與高磷-mimic-NC 組相比, #P<0.05。圖10 miR-30b 高表達對相關蛋白表達的影響(n=3)Note.a, High phosphorus group.b, High phosphorus-mimic-NC group group.c, High phosphorus-mimic-30b group.Compared with High phosphorus group, ?P<0.05.Compared with High phosphorus-mimic-NC group group, ?P<0.05.Figure 10 Effect of miR-30b overexpression on expression of related proteins

3 討論

心血管疾病死亡率增高的獨立危險因素是血管鈣化[7]。 而細胞凋亡是調控血管鈣化的重要機制之一[8]。 而參與細胞凋亡的機制有多種,高磷血癥是導致血管中膜鈣化的重要危險因素之一[9],而VSMCs 是血管中膜的重要組成成分。 因此本研究采用大鼠VSMCs,給予高磷刺激,探究血管平滑肌細胞凋亡和血管鈣化的發生機制。 本研究結果顯示,高磷可導致血管平滑肌細胞發生凋亡,其機制可能是通過下調miR-30b 表達,促進凋亡蛋白BAX表達,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達,進而引起血管平滑肌細胞發生了凋亡。

本研究給予高磷刺激,觀察細胞增殖凋亡情況。 MTT 結果提示高磷刺激的血管平滑肌細胞增殖顯著減弱,流式檢測結果提示高磷刺激的血管平滑肌細胞發生了凋亡。 有研究表明,高磷可誘導血管平滑肌細胞發生凋亡,與本研究結果一致[10]。 高磷誘導發生凋亡的血管平滑肌細胞中miR-30b 表達顯著降低,促進凋亡蛋白BAX 表達顯著升高,抑凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著降低。 表明miR-30b 參與了高磷誘導的VSMCs 的凋亡過程。

miRNAs 是一類小的內源性非編碼RNA,長約18~24 個核苷酸,具有調控功能,通過調節細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程調控血管鈣化[11]。研究發現miRNA30 家族參與調控血管鈣化[12-13]。有關人結直腸癌的研究發現miR-30b 可誘導細胞周期G1 的停止和細胞凋亡[14]。 有關人主動脈瓣的研究發現miR-30b 是主動脈瓣間質細胞的多功能調節器[6]。 Xu 等[15]在人肺成纖維細胞WI-38 細胞實驗中,下調miR-30b 后人肺成纖維細胞WI-38 細胞的BAX 表達升高,凋亡增加。 有研究證實,BAX 被激活并轉移到線粒體,引起線粒體外膜通透化,導致細胞破壞,誘導凋亡[16]。 BAX 和Bcl-2 是一對正負凋亡調節因子,BAX 起促進凋亡作用,Bcl-2 起抗凋亡作用[17]。 本研究為探究miR-30b 與VSMCs 凋亡的關系,給予轉染miR-30b 的抑制物,結果顯示,轉染miR-30b 的抑制物后,流式檢測結果及MTT 顯示,VSMCs 凋亡細胞增多、增殖顯著降低;促凋亡蛋白BAX 上調、抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達明顯下降,表明miR-30b 抑制物能夠上調BAX,下調Bcl-2,促進了VSMCs 發生凋亡。

綜上,本研究在體外實驗中發現高磷可促進血管平滑肌細胞發生凋亡,可能機制是通過抑制miR-30b 表達,促進BAX 表達,抑制Bcl-2 表達,進而導致VSMCs 發生凋亡。