大豆皂苷Bb 預處理對腦缺血再灌模型大鼠的神經保護作用

高 倩王建宇孟偉建李 靜崔永健魏 琰

(衡水市人民醫院(哈勵遜國際和平醫院)神經內二科,河北 衡水 053000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種因腦血管病變引起的腦供血不足而導致的具有嚴重并發癥和高死亡率的亞急性或急性腦血管類疾病,目前其已經成為全球性首位殘疾和第三致死的疾病[1-2]。 持續的腦缺血會造成腦神經的持續傷害,造成不良預后甚至死亡,因此,及早的恢復腦血灌流是治療IS 的主要治療策略[3]。 而再灌注也會加重最初由缺血引起的腦損傷,其還能引起缺血區神經元繼發性損傷,這種由再灌注引起的腦神經二次傷害嚴重影響患者的病后神經功能恢復[4-5]。 目前沒有特異性抑制腦缺血/再灌注( ischemia/reperfusion,I/R)損傷的方法。 如何改善腦I/R 所致的神經損傷已成為目前急需解決的問題。

腦I/R 損傷可導致神經元凋亡、氧化應激和炎癥級聯反應等一系列復雜的病理變化[6-7]。 大豆皂苷是一類主要從大豆中提取的三萜類齊墩果烷型皂苷,目前已確認了18 種大豆皂苷,根據化學結構分成A 類、B 類、E 類和DDMP 類[8-9]。 其中,大豆皂苷Bb(soyasaponin Bb,SSBb)是大豆皂苷中主要的活性化合物之一,已發現其在不同的疾病模型中具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、神經保護和防治心血管等多種藥理作用[10-11]。 根據SSBb 的藥理作用,推測其可能也會在腦I/R 中發揮神經保護作用,而具體作用并不清楚。 本研究以大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型觀察SSBb(灌胃給藥)預處理對MCAO 大鼠腦I/R 所致的腦損傷是否具有神經保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只SD 大鼠(6 周齡,SPF 級,雄性,體重:220~240 g)由北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0011]提供,將大鼠飼養在河北醫科大學新藥安全評價研究中心維持12 h/12 h 循環光照、濕度(60±5)%和溫度(22±3)℃的屏障環境動物房[SYXK(冀)2018-0005],大鼠可自由獲取食物和水。 本實驗使用動物的程序經衡水市人民醫院倫理委員會審查批準(2020-107),并符合實驗動物護理和使用指南的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

大豆皂苷Bb(SSBb,純度:99%;#51330-27-9),購自上海一基實業有限公司,使用時用生理鹽水配置成混懸液;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenytetrazolium chloride,TTC)染色液(#G3005)購自北京索萊寶生物科技有限公司;兔源微管相關蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗體(#AF4081)購自美國Affinity Biosciences 公司;小鼠源腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(#sc-12744)購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司;Cy3 標記的羊抗兔IgG(#BS10007)和FITC 標記的羊抗小鼠IgG(#BS50950)購自南京巴傲得生物科技有限公司;HRP 標記的羊抗兔IgG(#CLGRHRP)購自北京達科為生物技術有限公司; 兔源 β-actin 抗體(#WL01372)、RIPA 裂解液(#WLA017)和高敏ECL 化學發光試劑盒(#WLA003)購自萬類生物科技有限公司;兔源突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)(#ab18258)、兔源突觸素I(synapsin I)(#ab64581)和兔源突觸結合蛋白(synaptotagmin)(#ab131548)購自英國Abcam 公司;OCT 冰凍切片包埋劑(#4583)購自美國Tissue-Tek 公司。 真空干燥箱(型號:LVO-0B6020;上海龍躍儀器設備有限公司);電子天平(型號:BA2204;澳大利亞KEWLAB公司);激光共焦熒光顯微鏡(型號:LSM 980 with Airyscan;德國Carl Zeiss 公司);數碼顯微成像系統(型號:Moticam Pro 285C)(麥克奧迪實業集團有限公司);酶標儀(型號:EnVision;美國PerkinElmer 公司);蛋白質免疫轉印系統(型號:Tanon V8 ;上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗方案設計

大鼠經1 周的適應性喂養后,將其隨機分為假手術組,MCAO 組和低、高劑量SSBb 預處理組,每組15 只大鼠。 參照Zhang 等[12]方法,用線拴法對MCAO 組和低、高劑量SSBb 預處理組的大鼠行左側MCAO 術處理。 具體操作方式:大鼠麻醉后,仰臥位固定,頸部正中切口,結扎頸外動脈和頸總動脈近心端;用微血管夾夾閉頸總動脈遠心端,將線栓沿頸總動脈、頸內動脈,送入大腦中動脈約2 cm 處;并于缺血后2 h 抽出線栓,實現再灌注。 假手術組大鼠除不進行線拴結扎外,其余步驟程序同MCAO術。 為研究SSBb 預處理對腦I/R 的影響,低、高劑量SSBb 預處理組的大鼠在行MCAO 術前1 h,分別用灌胃針胃內注射20 和50 mg/kg SSBb(SSBb 的劑量參考大鼠實驗的報道[11]);假手術組和MCAO 組的大鼠行MCAO 術前1 h 給予等體積生理鹽水。

1.3.2 神經功能評估

在再灌注24 h 后,由1 名對分組不知情的實驗人員按照Zhang 等[12]的改良神經功能缺損評分量表(modified neurological severity score,mNSS)評估大鼠的神經功能缺陷。 NSS 評分在0~18 分之間,0分表示無神經功能缺陷,評分較高表示神經功能缺陷越嚴重,18 分表示持續性昏迷或死亡。

1.3.3 腦含水量檢測

用腦含水量法評估腦水腫[13]。 在神經功能缺損評分結束后,每組任選5 只大鼠,麻醉后,用頸椎脫位法處死。 然后迅速摘除大腦并稱重以獲得濕重。 在烘箱中60℃干燥24 h 后,直到重量不變,再次稱重以獲得干重。 腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4 TTC 染色

每組任選5 只大鼠,麻醉后,用頸椎脫位法處死。 取全腦并快速在-20℃下保存30 min。 用大鼠腦切片器切出連續11 個2 mm 厚的冠狀切片,然后侵入2% TTC 染液中在37℃下避光染色15 min。 取出切片,用PBS 清洗3 次,濾紙吸掉液體進行拍照。蒼白的未染色區表示梗死區域,紅色染色區表示正常組織。 用Image Pro Plus 測量每個切片的梗死面積;每切片梗死體積=各切片梗死面積×層厚(2 mm);總梗死體積為各切片的梗死體積之和。

1.3.5 免疫熒光

剩余大鼠經麻醉處死后,迅速切下大腦,在多聚甲醛中固定24 h,然后轉移到30%蔗糖溶液在4℃條件下放置48 h,然后嵌入OCT 冰凍切片包埋劑。 然后用冰凍切片機將大腦組織切割成6 μm 厚度的切片。 用PBS 沖洗3 次,在室溫下用5%山羊血清封閉30 min,在4℃下分別用兔抗MAP-2(1 ∶2000)和小鼠抗TNF-α(1 ∶500)在加濕室孵育過夜,用PBS 沖洗3 次,在室溫下分別用1 ∶1000 稀釋的Cy3 標記的羊抗兔IgG 和FITC 標記的羊抗小鼠IgG 的熒光二抗避光孵育2 h,用PBS 沖洗3 次,用DAPI 染細胞核5 min。 在激光共焦熒光顯微鏡下觀察,并隨機采集梗死和非梗死區域交界處的圖像并進行定量研究。 用Image Pro Plus 測量熒光強度,陽性表達水平= 積分光密度值(IOD)/視野面積×100%。

1.3.6 蘇木素-伊紅染色

將腦組織用石蠟包埋,并用石蠟切片機切為6 μm 厚度的切片。 腦切片經脫蠟至水后,按常規程序分別用蘇木素和伊紅染色液進行染色。 脫水封片后,顯微鏡下觀察腦組織形態表現。

1.3.7 蛋白質免疫印跡

收集缺血半暗帶腦組織,用RIPA 裂解法提取蛋白,用BCA 法量化每樣本蛋白濃度。 將80 μg 蛋白的樣本行SDS/PAGE 電泳分離并轉移到PVDF膜上。 然后,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,并在4℃下與適當稀釋比例的初級抗體孵育過夜。抗體稀釋濃度為:PSD95(1 ∶3000)、synaptotagmin(1 ∶2000)、synapsin I(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶10000)。 TBST 洗膜3 次,室溫下與1 ∶1000 稀釋的HRP 標記的羊抗兔IgG 孵育2 h。 用TBST 洗膜3次,使用ECL 增強化學發光系統觀察蛋白帶,并用Image Pro Plus 進行定量光密度值IOD。 陽性表達水平=目的蛋白(IOD)/β-actin(IOD)×100%。

1.4 統計學方法

用SPSS 19.0 分析軟件對所有數據進行統計學分析。 所有數據表示為平均數±標準差(±s)。 多組數據比較采用單因素方差分析法,組間均數兩兩比較采用事后LSD-t檢驗,P<0.05 表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 大豆皂苷Bb 預處理降低腦I/R 所致的神經功能障礙和腦水腫

通過mNSS 評分表和腦含水量來分別評估大豆皂苷Bb 預處理對腦I/R 誘導的神經功能障礙和腦水腫的影響。 如圖1A 所示,與假手術組相比,MCAO 組NSS 評分顯著升高(P<0.001),提示神經功能障礙;而低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理均顯著降低MCAO 大鼠的NSS 評分(P< 0.01 和P<0.001),提示大豆皂苷Bb 預處理降低MCAO 大鼠神經功能障礙,其中高劑量效果更為顯著(P<0.001)。 腦含水量檢測結果(圖1B)顯示,MCAO組腦含水量顯著高于假手術組(P<0.001),而低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理的MCAO 大鼠腦含水量均較MCAO 組顯著降低(P<0.01 和P<0.001),提示大豆皂苷Bb 預處理降低MCAO 大鼠的腦水腫,其中高劑量效果更為顯著(P<0.001)。

2.2 大豆皂苷Bb 預處理減輕腦I/R 后的腦梗死

用TTC 染色和MAP-2 免疫熒光染色評估大豆皂苷Bb 預處理對腦I/R 誘導腦梗死的影響。 TTC染色(圖2A、2C)結果顯示,與假手術組相比,MCAO組梗死體積顯著增加(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理組梗死體積均顯著降低(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。 MAP-2 免疫熒光染色(圖2B、2D)結果顯示,與假手術組相比,MCAO 組MAP-2 熒光強度顯著降低(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理組MAP-2 熒光強度均顯著增加(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。 這些結果提示,大豆皂苷Bb 預處理可改減輕腦I/R 后的腦梗死。

2.3 大豆皂苷Bb 預處理抑制腦I/R 誘導的炎癥反應

為明確大豆皂苷Bb 預處理對腦I/R 誘導的炎癥的影響,采用HE 染色法觀察腦I/R 后24 h 腦組織形態,免疫熒光法檢測腦組織中TNF-α 的表達水平,并用MAP-2 顯示缺血半暗帶。 HE 染色結果(圖3A)表明,假手術組腦組織形態和細胞結構基本正常;MCAO 組腦組織顯示水腫和炎性細胞浸潤現象,組織中的部分細胞可見細胞核碎片、核固縮和凋亡小體;低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理組顯示腦組織水腫和炎性細胞浸潤現象減輕,組織中細胞形態也趨向正常。 免疫熒光染色結果(圖3B~3D)表明,與假手術組比較,MCAO 組TNF-α 熒光強度顯著增高(P<0.001);與MCAO 組比較,低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理組TNF-α 熒光強度均顯著降低(P<0.01和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。這些結果表明大豆皂苷Bb 可以減輕腦I/R 導致的炎癥反應。

2.4 大豆皂苷Bb 預處理抑制腦I/R 誘導的突觸相關蛋白的表達

Western blot 結果(圖4)顯示,與假手術組相比,MCAO 組PSD95、synaptotagmin 和synapsin I 的表達水平均顯著降低(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預處理組上述蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001),這表明大豆皂苷Bb 抑制腦I/R 誘導的神經細胞的軸突損傷。

注:A:各組大鼠的NSS 評分;B:各組大鼠的腦含水量。 與假手術組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖1 大豆皂苷Bb 預處理可以降低腦I/R 所致的神經功能障礙和腦水腫(n=5)Note.A, NSS scores of rats in various groups.B, Brain water contents of rats in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 1 SSBb pretreatment reduces neurological dysfunction and brain edema caused by brain I/R

注:A:代表性的TTC 染色圖像;B:代表性MAP-2 染色切片的熒光顯微圖像顯示的腦梗死區域(MAP-2 為亮紅色點,細胞核為亮藍色點);C:各組梗死體積;D:各組MAP-2 的相對熒光強度。 與假手術組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖2 大豆皂苷Bb 預處理減輕大鼠腦I/R 后的腦梗死(n=5)Note.A, Representative images of TTC staining.B, Representative fluorescence microscopy images of MAP-2 stained sections showing the infarction areas in the brain (MAP-2 appears as bright red dots, while the nucleus is represented as bright blue spots).C, Infarct volume in various groups.D, Relative fluorescence intensity of MAP-2 in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 SSBb pretreatment alleviates cerebral infarction after cerebral I/R in rats

注:A:各組腦組織代表性HE 染色圖像;B:缺血半暗帶中MAP-2 和TNF-α 免疫熒光定位圖像;C、D:半暗帶中MAP-2 和TNF-α 的相對熒光強度。 與假手術組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖3 大豆皂苷Bb 預處理抑制腦I/R 誘導的炎癥反應(n=5)Note.A, Representative HE staining images of brain tissues in each group.B, Immunofluorescence localization of MAP-2 and TNF-α in ischemic penumbra area.C, D, Relative fluorescence intensity of MAP-2 and TNF-α in the penumbra region.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 3 SSBb pretreatment inhibits inflammatory response induced by cerebral I/R

注:A:各組代表性PSD95、synapsin I 和synaptotagmin 的Western blot;B~D:各組PSD95、synapsin I 和synaptotagmin 的蛋白表達的定量分析。 與假手術組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖4 大豆皂苷Bb 預處理對腦I/R 后突觸相關蛋白表達的影響(n=5)Note.A, Representative Western blot electrophoregrams of PSD95, synapsin I and synaptotagmin in each group.B~D, Quantification analysis of the expression levels of PSD95, synapsin I and synaptotagmin proteins in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 4 Effect of SSBb pretreatment on the expression of synaptic-associated proteins after cerebral I/R

3 討論

腦卒中是導致死亡和神經功能障礙的主要原因[1-2],而IS 在所有類型的腦卒中病例中約占80%~85%[14]。 先前的研究已經證實,腦I/R 會導致腦血管損傷和血腦屏障的破壞,以及神經元損傷的級聯效應[6-7,15]。 目前還沒有阻斷腦I/R 的有效策略,因此,關于如何減少腦I/R 損傷的不良影響,仍需要做大量的工作。 本研究顯示SSBb 預處理能減輕腦I/R 后神經功能損傷、腦水腫和腦梗死,提示其可能是潛在的用于IS 的神經保護劑。

腦I/R 損傷會加重腦缺血引發促炎介質的釋放、細胞死亡、軸突損傷和再生抑制[4-5]。 抗炎、抗凋亡和維持損傷神經元的存活是神經系統保護和再生的重要過程。 各種促炎細胞因子的釋放引起的炎癥級聯反應是腦I/R 炎癥損傷的主要機制[16]。TNF-α 是一種強促炎細胞因子,在缺血性腦損傷中發揮多效性功能[17]。 在先前不同疾病類型的研究中顯示SSBb 具有抑制炎癥作用[10-11]。 在本研究中,也證明了SSBb 預處理能減少缺血半暗帶中TNF-α 的表達,提示其在腦I/R 模型大鼠中也具有抗炎作用。

突觸是中樞神經系統神經元之間的接觸位點,有助于信息的處理、傳遞和存儲。 樹突棘是一種分散在許多類型神經元的樹突上的微小突起,是興奮性突觸的主要靶點[18]。 大腦中血流減少90%,10~20 min 內就會導致樹突棘丟失和不可逆的樹突損傷[19]。 在急性MCAO 模型中,缺血性卒中不僅會導致梗死缺血區的神經元死亡,還會損害缺血半暗帶區域的神經元結構[20]。 中樞神經元的棘和樹突是突觸信號傳導的重要位點,其也是缺血后最易損傷的結構,其結構破壞會中斷神經元回路和損害大腦突觸發生的功能。 為增加突觸發生,神經元會增加樹突分枝的形態學改變,使大腦能夠重組神經元回路,增加與突觸調節相關的神經遞質釋放。synaptotagmin 是突觸囊泡的對接和與神經元膜的融合的關鍵蛋白[21]。 Synapsin I 是一種促進突觸囊泡形成、突觸發生和調節神經遞質釋放的蛋白[22]。PSD-95 是樹突棘突觸后密度中的一種主要支架蛋白[23]。 本研究結果表明,SSBb 預處理可以明顯增加腦I/R 損傷后synaptotagmin、synapsin I 和PSD-95的表達,表明SSBb 預處理在突觸發生中的潛在作用。

本研究結果表明,SSBb 預處理能夠減輕大鼠腦I/R 損傷引起的神經功能缺陷、腦水腫及腦梗死,并且能夠促進突觸相關蛋白的表達,具有神經保護作用。