卒中相關(guān)性肺炎大鼠模型胃腸動力和腸道病理改變的實驗研究▲

黎仁玲 謝愛澤* 呂軍影

1 廣西醫(yī)科大學，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021

卒中相關(guān)性肺炎(stroke-associated pneumonia，SAP)是指非機械通氣的卒中患者在卒中發(fā)病后7 d內(nèi)新出現(xiàn)的肺炎[1]，常伴有發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽、咳痰等臨床癥狀，是卒中后最常見的并發(fā)癥之一。英國一項納入9238名卒中患者的大型隊列研究表明SAP的發(fā)生率為11.7%，SAP不僅增加患者的死亡風險、延長住院時間，還會影響患者預后[2]。建立合適的動物模型是研究SAP發(fā)生發(fā)展過程與治療方法的重要手段。目前關(guān)于SAP動物模型的建立方法尚無統(tǒng)一標準，學界仍在積極探索。胃腸功能障礙是腦卒中患者的又一常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為腹脹、腹瀉、便秘、營養(yǎng)不耐受等，嚴重影響患者的心理健康與疾病預后。王小波[3]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，便秘與SAP的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關(guān)，通腑中藥能有效地改善SAP患者臨床癥狀，但其作用機制尚不明確。本研究采用線栓法結(jié)合氣管注射銅綠假單胞菌法建立SAP大鼠模型，觀察SAP大鼠的胃腸動力和腸道病理變化，為進一步探究SAP胃腸功能障礙機制和改善SAP胃腸動力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，7～8周齡，體質(zhì)量(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2014-0002。所有大鼠在干預前適應性飼養(yǎng)3 d：廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，20～25 ℃，相對濕度為45%～65%，12 h黑暗與12 h光照循環(huán)以模擬正常晝夜周期，自由飲水進食。實驗方案及操作經(jīng)廣西醫(yī)科大學動物實驗委員會審查批準(編號：202009023)，符合實驗動物倫理學要求。動物使用許可證號：SCXK(桂)2014-0003。

1.1.2 實驗菌株 銅綠假單胞菌標準菌株[編號：CMCC(B)10104]購于上海魯微科技有限公司。經(jīng)常規(guī)方法復蘇培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水配制濃度為4×108CFU/mL的銅綠假單胞菌細菌懸液。

1.1.3 主要實驗材料、試劑與儀器 大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO )線栓(規(guī)格：L3600)購自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；2%氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液購自北京索萊寶科技有限公司；HE染色試劑來自廣西醫(yī)科大學免疫組化實驗室；Olympus正置四色熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號BX53)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 將12只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組和模型組，每組6只。模型組大鼠采用線栓法結(jié)合氣管注射銅綠假單胞菌法建立SAP模型：吸入濃度為3%～4%流速為0.6～0.8 L/min的異氟烷誘導大鼠麻醉，然后將大鼠以仰臥位固定于無菌操作臺上，吸入濃度為1%～2%流速為0.6～0.8 L/min的異氟烷維持大鼠麻醉。頸部備皮、消毒、鋪巾，于頸部正中偏右側(cè)縱向切開皮膚1.5 cm，鈍性分離暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈；用絲線結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈近心端，另取絲線懸拉阻斷頸內(nèi)動脈血流，在距離頸總動脈分叉處5 mm的血管壁上橫向剪開一小切口；用鑷子夾取線栓從切口緩慢插入，同時放松懸拉的絲線并緩慢推入線栓約2 cm，使線栓頭端到達大腦中動脈起始處，以有抵觸感為度，固定線栓并剪去多余線栓及絲線；分離氣管，用1.0 mL注射器注入0.2 mL銅綠假單胞菌懸液，注入后將大鼠豎立30 s并左右均勻擺動，使細菌懸液均勻分布于兩肺；消毒、逐層縫合手術(shù)切口。假手術(shù)組大鼠操作步驟同模型組，結(jié)扎頸動脈后不插入線栓，不注入銅綠假單胞菌懸液。

1.2.2 觀察大鼠一般狀態(tài) 造模后24 h時，比較兩組大鼠的狀態(tài)、被毛、活動度、呼吸、鼻周分泌物、糞便等一般情況，記錄體質(zhì)量與體溫。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 造模后24 h時采用Longa評分法對兩組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。無神經(jīng)功能缺陷癥狀，計0分；輕度神經(jīng)功能缺陷，不能完全伸展手術(shù)對側(cè)前爪，計1分；中度神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈，計2分；重度神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對側(cè)傾倒，計3分；意識昏迷或者不能行走，計4分。分數(shù)越高表示大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.4 胃腸動力檢測 完成神經(jīng)功能缺損評分后，處死大鼠前給予黑色半固體(0.5%羧甲基纖維素鈉 ∶碳素墨水比例為9 ∶1混合物)2 mL灌胃，20 min后用異氟烷誘導麻醉大鼠，麻醉成功后用組織剪沿腹正中線剪開，暴露腹腔，用絲線結(jié)扎胃賁門、幽門與盲腸末端，迅速分離胃賁門至盲腸末端組織。輕輕分離腸系膜后展開胃腸組織，測量幽門至黑色半固體前沿的距離及幽門至回腸末端的距離。剪下從賁門及幽門處的胃組織稱量胃總重，用生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物后稱量胃凈重。胃殘留量=胃總重-胃凈重。小腸推進率=幽門至黑色半固體前沿的距離/幽門至回腸末端的距離×100% 。

1.2.5 肺組織勻漿銅綠假單胞菌培養(yǎng) 用滅菌組織剪剪開大鼠胸部，取大鼠的右肺上葉，稱重后使用組織研磨機進行研磨獲取勻漿，用無菌生理鹽水稀釋10倍得到勻漿液，取20 μL勻漿液涂于普通營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.6 肺、結(jié)腸組織HE染色 選取大鼠的右肺下葉及盲腸下約1 cm處的結(jié)腸組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，將固定好的組織制作石蠟包埋、切片、蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，通過顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.2.7 腦組織TTC染色 取完上述組織后，兩組分別隨機選取3只大鼠取腦組織行TTC染色。方法如下：斷頭取腦組織于-20℃冰凍30 min；將冰凍腦組織冠狀位切成2 mm厚片，將切片浸泡于2% TTC染色液中，37℃避光孵育30 min；取出染色好的腦組織切片于4%多聚甲醛溶液中固定6 h；取出固定好的腦組織切片排列拍照保存。正常組織被染成紅色，腦梗死區(qū)不被染色。

1.2.8 腦組織HE染色 兩組余下3只大鼠取腦組織行HE染色。方法如下：游離心臟，剪開左心室一小口插入灌注針并固定，作為灌注液注入口，剪開右心耳作為灌注液流出口，夾閉胸、腹主動脈；經(jīng)灌流針快速灌注4℃生理鹽水200 mL，直到右心耳流出液澄清，再快速灌注4℃ 4%多聚甲醛溶液200 mL；斷頭取腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h以上，將固定好的組織制作石蠟包埋、切片、HE染色，通過顯微鏡觀察腦組織病理改變。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠一般狀態(tài)的比較 造模后24 h時，假手術(shù)組大鼠一般狀態(tài)良好，被毛平順有光澤，活動靈敏，呼吸平順，鼻頭濕潤干凈；模型組大鼠狀態(tài)差，被毛亂而無光澤，活動明顯減少，呼吸急促，打噴嚏，鼻周有大量分泌物。造模后24 h時，模型組大鼠體重為(239.333±3.204)g，輕于假手術(shù)組大鼠體重(281.833±6.369)g(t=14.601，P<0.001)；模型組大鼠體溫為(39.02±0.42)℃，高于假手術(shù)組大鼠體溫(37.95±0.33)℃(t=4.897，P=0.001)。

2.2 兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較 造模后24 h時，模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分為(2.50±0.55)分，高于假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分(0分)(t=11.180，P<0.001)。

2.3 兩組大鼠胃腸動力情況的比較 模型組大鼠的胃殘留量為(1.258±0.342)g，假手術(shù)組大鼠的胃殘留量為(0.862±0.422)g，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.789，P=0.104)。模型組大鼠的小腸推進率為(50.2±5.1)%，低于假手術(shù)組的(67.5±7.4)%(t=4.703，P=0.001)。

2.4 兩組大鼠肺組織勻漿培養(yǎng)結(jié)果的比較 假手術(shù)組大鼠的肺組織勻漿培養(yǎng)后未見菌落生長；模型組大鼠的肺組織勻漿培養(yǎng)后可見培養(yǎng)基呈典型的藍綠色，培養(yǎng)基表面見扁平濕潤、邊緣不整齊的菌落生長，經(jīng)廣西醫(yī)科大學微生物學實驗室鑒定為銅綠假單胞菌菌落。見圖1。

假手術(shù)組 模型組

2.5 兩組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果的比較 假手術(shù)組大鼠未見腦梗死灶，模型組大鼠可見明顯缺血性梗死灶，以皮層梗死為主。見圖2。

假手術(shù)組 模型組

2.6 兩組大鼠腦組織病理學的比較 假手術(shù)組大鼠腦組織可見大部分神經(jīng)元分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，細胞無顯著腫脹或皺縮，間質(zhì)均勻，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，分布不均，細胞間隙增大，細胞皺縮，結(jié)構(gòu)模糊，炎性細胞浸潤。見圖3。

假手術(shù)組 模型組

2.7 兩組大鼠肺組織病理學的比較 假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡輪廓清晰，肺泡腔干凈無滲出，肺間質(zhì)無出血、水腫、炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺組織以細支氣管為中心發(fā)生實變，肺泡輪廓隱約可見，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細胞滲出，肺間質(zhì)水腫、增厚、大量炎性細胞浸潤。見圖4。

假手術(shù)組 模型組

2.8 兩組大鼠結(jié)腸組織病理學的比較 假手術(shù)組大鼠結(jié)腸黏膜上皮層細胞完整、排列整齊，黏膜固有層腺體結(jié)構(gòu)清晰，杯狀細胞豐富，黏膜下層少見或無炎性細胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮層細胞缺失，固有層腺體排列紊亂，可見較多炎性細胞與紅細胞浸潤，黏膜下層可見血管增生。見圖5。

假手術(shù)組 模型組

3 討 論

我國國家卒中登記中心的資料顯示缺血性卒中患者的SAP發(fā)生率為11.4%[4]。研究認為SAP與卒中誘導的免疫抑制、吞咽困難、誤吸、細菌定植等因素相關(guān)，是卒中患者重要的致死原因之一[5-7]。除了根據(jù)病原菌培養(yǎng)結(jié)果選擇敏感的抗生素外，中醫(yī)藥在改善SAP患者癥狀中發(fā)揮了重要作用，但其作用機制仍不明確。動物模型為探討中醫(yī)藥治療SAP的作用機制提供了良好的條件，但目前學界尚無關(guān)于SAP動物模型建立的統(tǒng)一標準。現(xiàn)有研究中SAP動物模型的建立方法主要有線栓法結(jié)合氣管注射細菌法、線栓法結(jié)合細菌滴鼻法、線栓法自發(fā)細菌感染，以及四動脈阻斷法自發(fā)肺部感染等[8-11]。線栓法是目前較為成熟的建立MCAO模型的方法，本課題組前期探索發(fā)現(xiàn)，腦梗死SD大鼠在SPF級環(huán)境中并未出現(xiàn)自發(fā)生肺部感染，而線栓法結(jié)合細菌接種可以確保每只大鼠模型均能感染一定數(shù)量的外來細菌，因而能較好地建立大鼠肺部感染模型。在此基礎上，我們比較線栓法分別結(jié)合細菌滴鼻法、經(jīng)口腔氣管插管法和氣管注射細菌法建立的SAP模型，認為線栓法結(jié)合氣管注射細菌法建立SAP大鼠模型可控性好、成功率最高，且操作簡便、可重復性好[12]。

本實驗使用線栓法結(jié)合氣管注射銅綠假單胞菌法建立SAP大鼠模型，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，對側(cè)肢體偏癱，腦組織TTC染色和HE染色可見明顯的缺血和壞死，提示線栓法成功使大鼠發(fā)生腦卒中；肺組織勻漿銅綠假單胞菌培養(yǎng)陽性、HE染色可見典型肺實質(zhì)病變，提示氣管注射銅綠假單胞菌法成功建立了肺部感染模型。造模后24 h時模型組大鼠出現(xiàn)體溫升高、鼻周分泌物增多、呼吸喘促等癥狀，表示成功模擬了腦卒中患者急性期并發(fā)肺部感染的臨床癥狀，且這些癥狀符合中醫(yī)學痰熱證的證候特點，這為研究清熱化痰藥治療SAP患者的作用機制提供了一定的參考依據(jù)。

腦卒中患者常并發(fā)胃腸功能紊亂，康復機構(gòu)的腦卒中患者便秘的發(fā)生率高達80%[13]。研究認為腦腸之間存在包括腸道菌群在內(nèi)的腦腸軸，即大腦的病變可能通過神經(jīng)、免疫、微生態(tài)等途徑影響腸道的生理病理過程[14]。在本研究中，模型組大鼠胃腸動力受到影響，其中小腸推進率較假手術(shù)組大鼠明顯降低(P<0.05)；兩組大鼠胃殘留量差異雖無統(tǒng)計學意義，但模型組胃殘留量稍高于假手術(shù)組，提示模型組大鼠存在胃腸動力的減退。此外本研究通過HE染色觀察到模型組大鼠的結(jié)腸組織出現(xiàn)炎性浸潤、結(jié)構(gòu)破壞等病理改變，提示模型組大鼠腸道屏障受損。中醫(yī)學認為“肺與大腸相表里”，肺與大腸在經(jīng)絡上互為表里，肺病經(jīng)過傳變也會影響大腸的生理功能。肺為氣之主，肺氣的宣發(fā)與肅降會影響全身氣機，肺氣的宣發(fā)肅降失常則影響大腸的氣化傳導。肺主通調(diào)水道，與大腸主津相輔相成，水液輸布失常則津虧腸燥或下利泄瀉。因此SAP模型大鼠出現(xiàn)胃腸動力減退，除了與大腦的病變有關(guān)，還可能與中醫(yī)學之經(jīng)脈絡屬、氣機升降失常和水液輸布代謝相關(guān)[15]。關(guān)于并發(fā)肺部感染是否進一步加重了腦梗死大鼠的胃腸功能障礙，未來我們將進一步通過實驗進行驗證。

綜上所述，本研究采用線栓法結(jié)合氣管注射銅綠假單胞菌法建立的SAP模型能較好地模擬臨床SAP患者，且該模型大鼠出現(xiàn)明顯的腸道病理改變和胃腸動力減退，為SAP胃腸功能障礙的研究奠定了良好的基礎。