宮頸HR-HPV感染與陰道菌群失調及酸堿度的關系研究

臧文紅，杜洪靈，蔡驍垚，金姝1，

1.南華大學衡陽醫學院，湖南衡陽 421001；2.上海市普陀區人民醫院婦產科，上海 200060；3.上海市普陀區人民醫院中心實驗室，上海 200060

眾所周知，宮頸高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）持續感染會導致90%以上的宮頸癌，而對導致宮頸HR-HPV 持續感染的原因尚不清楚，國內外大量的研究發現陰道乳酸菌減少、細菌多樣性增加與其有密切關系[1-2]，罕見報道陰道酸堿度變化對其影響。足夠的證據表明酸化作用對單純皰疹病毒、淋球菌等性傳播病原體及細菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）相關厭氧菌都有明確的殺滅抑制作用[3-4]。HR-HPV 是陰道眾多病原菌之一，他們有共同的陰道環境。本研究選取2019 年4—8 月上海市普陀區人民醫院婦科門診要求體檢的符合入選條件的女性150 例，剔除陰道細菌DNA提取擴增不達標樣本后以102例樣本測序納入研究，分析宮頸HR-HPV 感染、陰道菌群、酸堿度三者之間的關系，以期探討HR-HPV 持續感染的原因，為清除HPV 感染提供新思路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取上海市普陀區人民醫院婦科門診要求體檢的女性150 例。研究經上海市普陀區人民醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象知情同意。根據宮頸HR-HPV檢測結果將至少檢出1種HR-HPV者定義為HPV 陽性，未檢出HR-HPV 者定義為HPV 陰性。將成功測序的102 例患者分為HPV 陽性組（n=37）和HPV 陰性組(n=65)。HPV 陽性組20～52 歲，平均年齡（33.08±9.12）歲；HPV 陰性組23～51 歲，平均年齡（35.77±8.10）歲。兩組年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。具有可比性。陰道液pH≤4.1 為正常，pH≥4.4為升高。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①月經規律，有性生活史，年齡＞18歲；②月經干凈1 周,無性生活，無陰道沖洗上藥；③近1 個月無全身或局部應用抗生素、激素；④無外陰瘙癢，無白帶增多、異味，無陰道異常出血；⑤無宮內節育器。排除標準：①妊娠婦女；②糖尿病患者及肝腎功能不全患者；③有惡性腫瘤史患者。

1.3 方法

①樣本采集：用一次性無菌擴陰器擴張陰道，充分暴露宮頸，用無菌棉拭子繞宮頸旋轉擦拭陰道穹隆3 周，采集時禁忌碰觸其他部位避免污染。采集好的拭子放置在干燥無菌試管中置于陰涼干燥處，2 h 內剪切下棉頭置于專用試管內轉移至-80℃液氮冰箱凍存。之后取一根棉拭子置于陰道穹隆浸濕，取出后轉移至pH 試紙，比色并記錄pH 值。最后取專用無菌刷按說明書采集宮頸細胞樣本保存，送該院病理科行HR-HPV 檢測。②宮頸HR-HPV 檢測：使用上海之江生物科技股份有限公司出品的HPV分型核酸測定試劑盒，采用實時熒光PCR 技術，按照說明書分型檢測16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82 共計15 個亞型。③陰道pH 值測定：使用上海三愛思試劑有限公司生產的pH3.8～5.4 精密試紙。④陰道細菌DNA 提取、PCR 擴增、測序：將-80℃冰箱標本批量取出后，放置干冰轉運箱中，運送至上海鯨舟基因科技有限公司。標本解凍、離心后按標準流程抽取DNA，對16s rDNA 的V3+V4區擴增，PCR產物經檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。僅以評級A 的樣本102 個進行下一步測序。PCR 試驗采用Trans-Gen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl 反應體系。參照Illumina 測序平臺的正規操作步驟，將純化定量后的擴增產物構建Miseq 文庫，使用Illumina 公司的測序平臺Miseq PE300 進行測序，比對Silva132/16s-bactera 數據庫，采用RDP classifer 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行物種注釋，并在門、綱、目、科、屬各個分類水平統計每個樣本的群落組成。豐度＜0.01%的物種合并為其他。

1.4 觀察指標

①比較兩組陰道微生物群落物種組成、豐度和多樣性差異。計算樣本菌群豐度的指數有Chao、Ace，用來估計物種總數；用來估算樣本中微生物多樣性的指數有Shannon、Simpson，Shannon 指數越大，物種多樣性越高，Simpson指數則相反。本測序覆蓋率99.9%；②陰道酸堿度升高、HPV 感染、陰道菌群結構三者的關系。

1.5 統計方法

利用R 軟件分析作圖，物種累積曲線判斷樣本量充分，稀釋曲線判斷樣本測序數據量合理。α 多樣性指數（chao、ace、shannon、simpson）分析判斷樣本微生物群落的豐度和多樣性。根據OTU 注釋結果分別在門、綱、目、科、屬各個分類水平統計組間物種組成和相對豐度，使用R 軟件用Wilcoxon 秩和檢驗分析判斷組間菌種差異。采用SPSS 20.0 統計學軟件處理數據，計量資料符合正態分布，方差相等，采用（±s）表示，組間比較進行t檢驗。計數資料采用[n(%)]表示，組間比較進行χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組陰道細菌菌群豐度和多樣性比較

兩組陰道菌群豐度和菌群多樣性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組陰道細菌菌群豐度和多樣性指數比較(±s)

表1 兩組陰道細菌菌群豐度和多樣性指數比較(±s)

指數Ace Chao Shannon Simpson HPV陽性組（n=37）92.154±54.156 83.274±55.891 1.178±0.558 0.483±0.236 HPV陰性組（n=65）93.686±64.934 83.577±61.471 1.039±0.579 0.542±0.237 t值-0.121-0.025 1.182-1.211 P值0.904 0.980 0.240 0.229

2.2 兩組陰道細菌物種組成

兩組陰道細菌在門水平的物種組成：HPV 陽性組和HPV 陰性組都以厚壁菌門為主（76.91% vs 80.82%）（P=0.197），其次是放線菌門（13.24% vs 11.51%）（P=0.099）、變形菌門（2.94% vs 4.30%）（P=0.862）、擬桿菌門（3.89% vs 1.96%）（P=0.405）和梭桿菌門（2.57%vs 1.01%）（P=0.469）。差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 兩組樣本門水平物種組成柱狀圖

兩組陰道細菌在屬水平的物種組成：HPV 陽性組和HPV 陰性組均以乳酸桿菌為主，占比接近（73.60% vs 75.37%）（P=0.221）。其次是加德納菌（10.37% vs 7.48%）（P=0.073）、小球藻（3.50% vs 1.46%）（P=0.181）、斯內西亞菌（2.56% vs 1.00%）（P=0.264）、奇異菌（2.46%vs 1.09%）（P=0.051）等厭氧菌屬，HPV 陽性組較HPV 陰性組占比增多，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 兩組樣本屬水平物種組成柱狀圖

2.3 陰道菌群結構類型與陰道PH 和HPV 感染的關系

根據細菌16SrRNA 高通量測序的結果，將屬水平菌種占比＞50%者定義為優勢菌，將陰道群落結構分為3 種類型：Ⅰ乳酸桿菌優勢型79 例（77.45%）；Ⅱ厭氧菌優勢型17 例（16.67%），包括加德納菌優勢11 例，雙歧桿菌2 例，鏈球菌1 例，志賀菌1 例，斯內西亞菌1 例，shuttleworthia 1 例；Ⅲ無優勢菌型6 例（5.88%），見表2。

表2 陰道菌群類型、pH與HPV感染的關系

陰道菌群結構與陰道酸堿度：隨乳酸桿菌減少陰道pH升高，乳酸菌優勢型與非乳酸菌優勢型相比[10.13%（8/79）vs 60.87%（14/23）]，差異有統計學意義（χ2=24.197，P＜0.001）。

陰道菌群結構與HPV感染：乳酸菌優勢型和非乳酸菌優勢型HPV感染率相比[35.44%（28/79）vs 39.13%（9/23）]，差異無統計學意義（χ2=0.105，P=0.746）。

HPV 感染與陰道酸堿度：pH 升高者較pH 正常者HPV 感染率增加[50.00%（11/22）vs 32.50%（26/80）]，但差異無統計學意義（χ2=2.286，P=0.131）。

3 討論

3.1 宮頸HR-HPV感染與陰道乳桿菌優勢

陰道與體外相通，正常女性陰道內有多種微生物存在。利用對細菌16SrRNA 高通量測序技術，2011 年Ravel 等[5]以占比50%以上的菌群為優勢菌，首次將健康育齡婦女的陰道菌群分為5 種類型（community state types，CST）：CSTⅠ、CSTⅡ、CSTⅢ和CSTⅣ四型均以乳酸桿菌為優勢菌，CSTⅣ型無優勢菌。大多數人以少量乳桿菌為主，CSTⅣ型菌群結構在少數健康女性中出現，種族地域存在差異[6]。成熟健康女性的陰道環境因性激素周期變化、月經血沖刷和性交等因素動蕩復雜，乳酸菌優勢和CSTⅣ互相轉化，但往往恢復較快，并不出現微生物群落多樣性的增加和乳酸水平的下降[7-8]。近期報道的一項跨度長達24 年的前瞻性研究，對比分析宮頸HPV16 獲得、持續、清除不同狀態陰道菌群變化發現，是否感染HPV16 陰道菌群多樣性并無差異，如果陰道環境長期不穩定，更多停留在CSTⅣ，則易發展為HPV 持續感染[9]。也有研究認為宮頸HPV 感染與陰道乳桿菌減少，菌群豐度和多樣性增加顯著相關[10-11]。本研究中HPV陽性和HPV陰性均以乳酸桿菌占主導地位，菌群豐度和多樣性相似，陰道是否乳酸菌優勢對HPV感染無明顯影響。

3.2 宮頸HR-HPV感染與陰道厭氧菌過度生長

厭氧菌致病機制：①對宮頸陰道黏膜屏障的影響和破壞，使病毒粒子易于通過[12]；②釋放細胞毒物質（酶和代謝物），分泌炎性細胞因子，產生顯著的細胞病變效應。CSTⅣ菌群結構與BV 相似，都以厭氧菌過度生長，多菌性生態失調為特征。文獻報道患有CSTⅣ樣病癥的女性陰道液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6（interleukin-6,IL-6）、γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、IL-1β、IL-4、IL-12p70、IL-10 和IL-8 升高[13]，這些促炎狀態導致組織損傷，可能增強人乳頭狀瘤病毒的致癌潛力。研究證實這種菌群結構清除HPV的能力最差，HPV 陽性樣本比例最大，而且隨CIN 進展，CSTⅣ型比例增加[14]。近期研究發現宮頸HR-HPV 感染婦女的陰道微生物群的特征是大量的細菌性陰道病相關細菌(bacterial vaginosis-associated bacteria, BVAB)，具有非乳桿菌占優勢的陰道微生物群的婦女感染HR-HPV 的人數成倍增加[15]。本研究中，HPV 陽性組較HPV 陰性組加德納菌、小球藻、斯內西亞菌、奇異菌等厭氧菌屬占比明顯增多（18.89%vs 11.02%），還發現厭氧菌優勢較乳酸菌優勢并未增加HPV 感染（29.41% vs 35.44%），無優勢菌型HPV 感染成倍增加（66.67%），雖結果一致，但樣本量不足。鑒于宮頸HPV 感染絕大多數可以自然清除，故一般認為陰道菌群失調不是HPV 感染的必要條件，主要是影響HPV的清除能力。

3.3 陰道酸化殺菌與HPV感染、陰道菌群

一般陰道pH 值均以非乳桿菌屬的比例增加而增加，將育齡婦女陰道大量乳酸桿菌的出現和pH＜4.5 定義為“健康”，但并非絕對。pH 值升高也出現在一些具有高比例乳桿菌屬的群落中[7]。體內研究說明，由乳酸菌主導的陰道液pH＜4，有顯著的殺滅病原體作用[16]。本研究發現，乳酸菌優勢與陰道酸堿度顯著相關（P＜0.01），無優勢菌型全部pH 升高，推測陰道pH升高出現在多菌性菌群失調之前，乳酸桿菌減少，陰道酸化殺菌能力下降可能是導致陰道菌群失調的原因。病毒轉化的人乳頭瘤病毒E5 蛋白對低酸堿度特別敏感[17]，陰道酸堿度的升高有利于HPV 的復制。在一項對9 165 名哥斯達黎加婦女的研究中，顯示陰道酸堿度＞5 與絕經前婦女宮頸HR-HPV 陽性風險增加10%～20%顯著相關[18]。本研究中，陰道pH升高者和pH正常者相比，宮頸HRHPV 感染率由32.50% 上升到50.00%，增加了17.5%。

綜上所述，若導致陰道酸堿度升高的因素長期存在，或陰道酸化殺菌功能長期喪失，則可能出現多菌性陰道菌群失調和宮頸HR-HPV 持續感染。降低陰道酸堿度可能是一種直接有效的清除HPV 感染的方法，但相關研究報道極少，需要嚴謹科學的研究設計，進一步進行大樣本前瞻性研究。