胎兒游離DNA高通量測序在產前診斷中的應用價值

韓詠梅

淄博市婦幼保健院，山東淄博 255000

出生缺陷是指嬰兒出生前發生的身體結構、功能或代謝異常，可由染色體畸變、基因突變等遺傳因素或環境因素引起，也可由這兩種因素相互作用或其他不明原因所致。調查發現，我國是出生缺陷高發性國家，總發病率為5.6%，年均新增90萬例，而染色體異常占比0.5%～0.8%，也是引起出生缺陷的高危因素。目前，超聲檢查、早中孕期血清學篩查是產前篩查的首選方式，但后者呈現檢出率低（70.00%）、假陽性率高（5.00%）等缺陷，極易面臨漏診、誤診，增加不必要的介入產前診斷等行為。介入性產前診斷會增加自身負擔，面臨胎兒丟失（羊膜腔穿刺占比0.11%、臍靜脈穿刺占比0.35%）、宮內感染和胎膜早破等狀況，造成產婦及家庭等層面負擔。探尋更為準確、安全的產前篩查方式，盡早評估胎兒染色體是否異常，是增強產前診斷效率、質量的關鍵[1]。選取2020 年1 月—2021 年6 月淄博市婦幼保健院施行無創DNA 檢測孕婦共21 705 例為研究對象，明確胎兒游離DNA 高通量測序的價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院施行無創DNA 檢測孕婦共21 705 例為研究對象，平均年齡（31.62±5.03）歲、平均孕周（18.73±3.15）周。

1.2 方法

①采血。抽取10 mL 外周血置入Cell-Free DNA BCT 采血管（血漿游離DNA 采血管）內，上下顛倒8～10 次，保證其均勻混合，再張貼條碼做好標記；置于4～8℃環境下保存，48 h 內送往遺傳專科實驗室[2-3]。

②提取胎兒游離DNA。4℃環境下，將血樣經16 00 g離心處理，10 min后取上層清液再次16 000 g離心處理10 min，以此清除白細胞及碎片，獲取上層血漿。依據磁珠法，提取游離DNA，再聯合定量分析儀的運用鑒別其濃度[4-5]。

③建立DNA 測序庫。借助可逆末端終止測序法，建立相應的DNA 測序庫，以cffDNA 為準對其末端予以補平，再和測序通用引物連接；隨后構建文庫施行產物純化處理，聯合Stepone plus QPCR 儀予以定量測定[6-7]。

④數據測序和分析。借運用高通量基因測序儀，依據各流程標準施行測定，再將各數據傳遞至生物信息軟件，通過和基因組序列間的比較，獲取Z值（表明各染色體占比評分情況）。若Z值在-3.0～3.0為正常，＞3.0 表明為染色體三體，＜-3.0 表明為染色體單體高危[8-9]。

⑤介入性產前檢查、染色體核型。若胎兒cffDNA 檢測為高風險，應在其知情同意下施行介入性產前檢查。是以B 超引導為前提，妊娠18～23+6周時采取羊膜腔穿刺，≥24 周時采用經皮臍血穿刺，隨后施行細胞培養、染色等處理，獲取其核型[10]。

1.3 觀察指標

分析檢測結果、檢測篩查效率及妊娠結局。

靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100.00%；特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100.00%；假陽性率=假陽性/（假陽性+真陽性）×100.00%；陽性預測值=真陽性（真陽性+假陽性）×100.00%；陰性預測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100.00%[11]。

1.4 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料用（±s）表示；計數資料用[n(%)]表示。

2 結果

2.1 檢測結果

21 705 例無創DNA 篩查中，檢出異常者279例，占比1.29%。包括61 例為T21 三體高風險、18 例為T18 三體高風險、23 例為T13 三體高風險、126 例性染色體非整數倍異常、49 例為其他常染色體異常、2例為多條染色體異常。見表1。

表1 外周血cffDNA檢測結果及染色體核型

針對T21、T18、T13 三體高風險孕婦，取羊水穿刺法，施行染色體核型分析、FISH 聯合檢測；性染色體非整數倍異常、其他常染色體異常孕婦，取羊水穿刺法，施行染色體核型分析、基因芯片聯合檢測。

①T21 三體高風險者，羊水穿刺共55 例，包括：47,Xn,+21 核型34 例，46,Xn,r(21)(p13;q22.3)[88]/45,Xn,-21[12]核 型1 例，47,Xn,der(21)t(2;21)(p22.2;q21.3)+21 核型1 例，46,Xn 核型19 例。未羊水穿刺共6 例，包括1 例腦積水引產、1 例宮內胎兒死亡引產，但均未采取后續研究。

②T18 三體高風險者，羊水穿刺共14 例，包括：47,Xn,+18 核型12 例，46,Xn 核型2 例。未羊水穿刺共4 例，包括1 例胎兒心臟異常引產，但未采取后續研究。

③T13 三體高風險者，羊水穿刺共17 例，包括：47,Xn,+13 核型1 例，核型正常16 例。余下6 例未采取產前診斷，但1 例應多發畸形引產、1 例因唇腭裂引產。

④性染色體非整數倍異常（SCA）者，羊水穿刺共98例，包括：47,XYY核型8例，47,XXY核型15例，47,XXX 核型4 例，45,X 核型1 例，45,X/46,XX 嵌合核型3例，45,X/46,XY嵌合核型1例，45,X/47,XXX嵌合核型1 例，47,XXY/46,XY 嵌合核型1 例，46,X,?del(X)(p11.3p22.1)核型1 例。核型正常63 例，但基因芯片檢查中，檢出2 例致病性拷貝數變異，4 例臨床意義不明拷貝數變異。未采取產前診斷28 例，但1 例因唇腭裂引產、1例因胎膜早破引產。

⑤其他常染色體異常者，羊水穿刺共36 例，包括：46,XX,del(18)(p10)[52]/46,Xn,i(18)(q10)[8]核型1例，核型正常35 例，但基因芯片檢查中，檢出5 例致病性、可疑致病性拷貝數變異，7 例臨床意義不明拷貝數變異，8號染色體單親二倍體1例。未羊水穿刺共13 例，包括1 例宮內死亡引產、1 例心臟異常引產。

⑥多條染色體異常者中，羊水穿刺共1 次，核型、基因芯片檢查均未存在異常；1 例孕婦確診為淋巴漿細胞淋巴瘤后引產，但未采取后續研究。

2.2 檢測篩查效率

①T21 三體高風險，靈敏度為100.00%（36/36）、特異度為99.91（21 650/21 669）、假陽性率為0.09%（19/21 669）、陽性預測值為59.01%（36/61）、陰性預測值為100.00%（21 650/21 650）。②T18 三體高風險，靈敏度為100.00%（12/12）、特異度為99.99%（21 691/21 693）、假陽性率為0.01%（2/21 693）、陽性預測值為66.67%（12/18）、陰性預測值為100.00%（21 691/21 691）。③T13三體高風險，靈敏度為100.00%（1/1）、特異度為99.93%（21 688/21 704）、假陽性率為0.07%（16/21 704）、陽性預測值為4.35%（1/23）、陰性預測值為100.00%（21 688/21 688）。④SCA，靈敏度為100.00%（35/35）、特異度為99.71%（21 607/21 670）、假陽性率為0.29%（63/21 670）、陽性預測值為27.78%（35/126）、陰性預測值為100.00%（21 607/21 607）。⑤其他常染色體異常，靈敏度為100.00%（1/1）、特異度為99.84%（21 669/21 704）、假陽性率為0.16%（35/21 704）、陽性預測值為2.04%（1/49）、陰性預測值為100.00%（21 669/21 669）。⑥多條染色體異常，特異度為100.00%（21 704/21 705）、假陽性率為0.00%（0/2）、陽性預測值為0.00%（0/2）、陰性預測值為100.00%（21 704/21 704）。

2.3 妊娠結局

①外周血cffDNA 檢測異常者中，共隨訪276例，失訪3 例，隨訪率為98.92%。染色體異常者共83例，77 例已引產，余下6 例出生后表型未異常；核型正常者共144 例，因基因芯片異常引產9 例，電話隨訪135 例出生后無異常，58 例未施行介入性產前診斷，但6 例因彩超異常引產，2 例因胎死宮內引產，1 例因胎膜早破引產，1 例因孕婦患淋巴漿細胞淋巴瘤引產，余下45 例出生未見表型異常，失訪3 例。

②檢測結果未異常者21 426 例，電話隨訪妊娠結局共20 296 例，隨訪率為94.73%，其中1 425 例仍未分娩。包括流產21 例（0.11%）、胎兒發育停止28例（0.15%）、先天畸形47 例（0.25%）、出生后夭折18例（0.10%）。

3 討論

染色體異常作為胎兒出生缺陷的首要原因，由此產生的病癥均可稱為染色體病，常表現為多發畸形、生長發育遲緩及性發育障礙、重癥智力低下等，但目前仍沒有最佳治療方案，所以該類患兒出生往往會增加家庭、社會等層面負擔[12]。在此期間，產前篩查和診斷等工作的施行，可盡早發現疾病，通過針對性干預，降低染色體病患兒出生。例如：孕婦外周血cffDNA 檢測技術，以自身安全可靠、準確性高等特點成為產前篩查的首選，更是為遺傳咨詢提供助力，保證人口素質健康[13-14]。

諸多研究證實，腫瘤患者血漿內富含腫瘤細胞DNA，由此受到啟發。首次PCR 技術下測定孕婦外周血Y 染色體DNA 片段，從中獲取cffDNA，為產前篩查邁向新臺階。調查發現，妊娠4 周時母體血漿可檢出cffDNA，妊娠8周以上時濃度呈穩定狀態，并隨孕周的延長而增加，妊娠12 周后93.5%胎兒游離DNA 含量達4%，可滿足高通量測序的檢測要求；分娩后胎兒游離DNA 快速下降，產后72 h 消失，即以孕婦外周血漿cffDNA 為前提的產前篩查，不會受到既往妊娠的影響，還可為疾病篩查提供可靠依據[15-16]。

目前，產前篩查是以T21、T18 及T13 常見染色體非整倍體異常為目標染色體，且和血清學檢查相比呈現檢出率高、假陽性率低等優勢，是目前產前篩查的輔助項目。該研究可知，T21/T18/T13 復合靈敏度為100.00%，特異度分別為99.91%、99.99%、99.96%。和Zhou Q 等[17]學者研究結果相似，其研究結果T21、T18、T13 靈敏度均為100.00%，特異度分別為99.94%、99.90%、99.96%。

WHO 數據調查顯示，人類染色體異常中SCA 占據50%以上，且每400個表型正常群體中就會存在1例某種形式SCA，如47，XYY、47，XXX 及相關嵌合體，雖不表現為表型異常，但絕大部分胎兒會存在性功能發育障礙，少部分會表現為智力發育遲緩和性格改變。即使在胎兒正常出生后，經家屬自述為表型正常，但也不能忽略有染色體異常傾向。另外，外周血cfffDNA 產前篩查存在個別假陽性、假陰性事件，可能和限制性胎盤嵌合體、母體超重、母體染色體異常、母體患有惡性腫瘤等因素存在相關性[18]。該研究中有1 例高通量測序示胎兒多條染色體異常，孕婦確診為惡性腫瘤（淋巴漿細胞淋巴瘤），考慮為孕婦游離凋亡細胞的腫瘤DNA 釋放到血液循環中，被誤認為是胎兒的非整倍體。

綜上所述，孕婦外周血cffDNA 檢測是產前輔助篩查技術，呈現靈敏度和特異度高、假陽性率低等優勢，可彌補血清學篩查、B 超檢查等缺陷，其篩查結果更為精確，可避免漏診事件，還可減少不必要的介入性產前診斷，減輕胎兒死亡帶來的心理壓力，強化出生缺陷二級預防工作。