黃連根腐病病原菌分離純化及鑒定

鄧思怡，劉 軍，常 威，溫州權，汪 華*

(1.湖北省農業科學院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；2.華中作物有害生物綜合治理重點實驗室，湖北 武漢 430064；3.利川市農業技術推廣中心，湖北 利川 445400)

黃連(CoptischinensisFranch)又名雞爪連、川黃連等，是多年生草本植物[1-2]。黃連主要以根莖供藥用，由于其具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降糖等藥用活性，在醫療及保健等行業得到了廣泛應用，黃連種植具有廣闊的前景[3]。黃連在我國四川、貴州、湖南、湖北和陜西等省均有栽培，多產于海拔500 m～2000 m之間的山地森林或山谷陰處。湖北省利川市是我國黃連的主要產地之一。有41%的地區是海拔800 m～1200 m的山地，年均溫12.3℃，年降雨量1200 mm～1400 mm；海拔1200 m～2000 m的高山面積占比為52%，年均溫11.1℃，年降雨量1370 mm，生態環境非常適宜黃連的生長。2011年，利川市獲得中國中藥協會頒發的“中國生態黃連之鄉”稱號[4]。利川市黃連種植面積大，品質好，但在其栽培過程中，病害防治是產業上的難點。明確利川黃連重要病害的病原，對其病害防治具有重要意義。本研究對湖北省利川市的黃連樣品上的病原進行了分離和純化，結合形態學和分子生物學等方法對病原進行了鑒定，并通過柯赫氏法則測定其致病性，旨在為黃連病害生產防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年12月，由利川市農技推廣中心溫州權站長從湖北省恩施州利川市建南鎮采集的根部感病黃連植株，郵寄到實驗室進行分離培養。如圖1所示，樣品葉片干枯，呈紫紅色，發黑，根部可以觀察到黑褐色病部。

圖1 感病的黃連植株

1.2 試驗儀器

PDA固體培養基(馬鈴薯(200 g)煮提液，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，水1000 mL)；光學顯微鏡；植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 病原菌的分離

1.3.1 病樣處理

用滅菌剪刀將黃連地上部分剪去，根系以上留下約1 cm。將切下的黃連根系倒置于塑料杯中，根部朝上，并在杯底部加入無菌水，無菌水不宜漫到根部組織，用保鮮膜封上杯口。

圖2 感病的黃連根系

圖3 感病植株根系密閉培養

1.3.2 病樣組織塊初步培養

采用組織分離法[5]對黃連病葉及根部的病健交界處進行分離，用無菌手術刀切取0.5～1 cm大小的組織塊，用15%雙氧水清洗15 s，75%酒精清洗30 s，再用無菌水清洗3次，用滅菌濾紙吸干組織塊表面的水分，病部朝上置于PDA培養基中。于室溫下平放培養1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養2～3 d。

1.3.3 病樣菌絲及菌絲團初步培養

待密閉培養的黃連根部長出菌絲后，用滅菌牙簽挑取不同部位的菌絲，接種到PDA培養基中。于室溫下平放培養1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養2～3 d。

1.4 分離菌的純化

用滅菌牙簽挑取疑似病原菌進行純化培養。選取菌落外圍的菌絲，接種于PDA培養基中。于室溫下倒置培養3～5 d，置于4℃保存。

1.5 分子學鑒定

按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌DNA，使用2×PCR Master Mix試劑盒對菌株進行PCR擴增。選用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[6]進行擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環；72 ℃再延伸5 min。反應結束后進行1.0%瓊脂凝膠電泳檢驗。PCR產物送公司進行測序。

1.6 致病性測定

選取健康的黃連植株，每組5株，將根部沖洗干凈后，在無菌操作臺上對其進行滅菌，用75%酒精清洗2～3 s，再用無菌水清洗2～3次，用濾紙吸干表面水分，在濃度為106ofu/mL的孢子懸浮液中浸根30 min，對照組用無菌水浸根。將浸根后的植株栽培在滅菌的培養基質中，10 d后觀察黃連的發病情況，并對發病的黃連根部再次進行病原分離和鑒定。

2 結果與分析

2.1 發病癥狀鑒別

黃連健康植株根系發達，須根亮褐色，葉部嫩綠[7]。黃連根腐病主要危害根部，發病時須根變為黑褐色，干枯。葉面初期從葉尖、葉緣變紫紅色不規則病斑，逐漸變暗紫紅色。葉背面由黃綠色變紫紅色。受害葉呈萎蔫狀，后期干枯致死，病株很容易從土中拔起[8]。病樣根部有黑褐色部位，葉片紫紅色，與黃連根腐病癥狀相符。

2.2 菌落形態學鑒別

如圖4所示，純化的單菌落菌絲為白色，呈現放射狀分布，菌絲后期變為紅褐色。培養期間PDA無變色現象。菌落形態學與鐮刀菌相符。

圖4 分離出的單菌落

2.3 病原菌分子學鑒別

提取的病原DNA，經ITS序列分析，結果為鐮刀菌(Fusarium)。

2.4 致病性測定

用孢子懸浮液浸根的黃連植株上的發病癥狀與田間一致，頂端新葉黃化，須根變黑。對照的無菌水接種則沒有出現發病癥狀。對接種發病的黃連根系再次分離，均能純化出相同的病原菌。

3 結論

近年來，隨著人工種植面積擴大以及連作現象增加，病害的發生已經成為危害黃連產量和質量的重要因素。目前黃連主要病害有根腐病、白絹病、紫紋羽病、葉斑病、白粉病、炭疽病等，以根腐病為害尤甚。四川、湖北等地的調查結果表明，根腐病的常年發病率在40%左右[9]。本研究通過真菌ITS序列分析鑒定病原菌，并結合發病癥狀、病原菌形態學及致病性測定，確定樣品病害為黃連根腐病，其病原菌為鐮刀菌(Fusarium)，這為在生產中防治黃連病害提供了理論依據，之后可在此基礎上，開展黃連根腐病的致病機理、病原生物學以及防治等方面的研究。