超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定吊瓜中3種農藥殘留量的研究

高 迪，胡楚嬌，龍家寰，魏 進，張 盈，段婷婷*

(1.貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州醫科大學醫藥衛生管理學院，貴州 貴陽 550006)

吊瓜(TrivhosantneskirilouiiManim)，別名栝樓、瓜蔞等，葫蘆科栝樓屬植物，多年生攀援草木，雌雄異株，分布于我國遼寧、華東、華北、西南等地區[1]。《本草綱目》中有記載“瓜蔞仁，潤肺燥、降火、治咳嗽、利咽喉、止清渴”，無特殊味道，食用方式多樣。吊瓜仁富含脂肪油、三萜皂苷和蛋白質等物質，具有優良的保健與食用功能，因此吊瓜已經成為市面上“藥食同源”的休閑食品新選擇[2]。伴隨著吊瓜田間種植面積的擴大，其病蟲害問題日益凸顯出來。當前吊瓜上的主要病蟲害有：根結線蟲病、炭疽病、病毒病、透翅蛾、菱斑食植瓢蟲和瓜藤天牛等[3-4]，目前并沒有在吊瓜上登記的農藥，經過文獻查詢并結合實地走訪發現，吊瓜病蟲害的防治藥劑主要是烯酰嗎啉、敵敵畏、乙基多殺菌素、三唑酮和戊唑醇等[5]，參照農業部明令禁止使用的農藥名單[6]，本試驗選取烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇進行研究。

目前，關于烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇在常見農副產品上的殘留檢測多有相關報道，如草莓、葡萄、獼猴桃和辣椒等[7-10]，同時隨著這3種藥劑的使用范圍擴大，其在中藥材上的農藥殘留問題也逐漸得到重視，如三七、枸杞、人參等[11-13]。常見的檢測方法有液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)、高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)等，當前尚未見能同時檢測吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的試驗方法。由于吊瓜富含油脂和色素，基質成分較復雜，現有的檢測方法無法滿足吊瓜上的農藥殘留檢測條件，因此本試驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農藥在吊瓜上的殘留檢測方法；同時在貴州省息烽縣九莊鎮吊瓜種植基地進行農藥殘留田間試驗，對試驗后的吊瓜樣品進行農藥殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS，UItimate 3000/TSQ Vantage)，美國Thermo Fisher公司)；Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.1 μm，美國Thermos Fisher公司)；CK 200型高通量組織研磨器(北京托摩根生物有限公司)；電子分析天平(精度0.0001 g，德國sartorius公司)，XW-80A 渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TG 16-Ⅱ 離心機(湖南平凡科技有限公司)。

烯酰嗎啉標準品(純度99.7%，北京勤誠亦信科技開發有限公司)；乙基多殺菌素標準品(純度94.2%，北京勤誠亦信科技開發有限公司)；戊唑醇標準品(純度98.8%，北京勤誠亦信科技開發有限公司)；乙腈(分析純，天津市歐米克公司)、氯化鈉(分析純，成都金山化學試劑有限公司)；甲酸(分析純，天津市歐米克公司)；無水硫酸鎂(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國默克公司)；無水乙酸(色譜純，天津市光復科技發展有限公司)； PSA、GCB [安捷倫科技(中國)有限公司];0.22 μm有機系濾膜(日本島津公司)。

吊瓜樣品采自貴州息烽九莊鎮吊瓜基地，試驗按照1.4節進行。

1.2 樣品前處理

稱取5.0 g均質吊瓜瓜子仁于50 mL塑料離心管，加入10 mL含1%乙酸的乙腈溶液和10 mL蒸餾水，渦旋振蕩15 min，加入4.0 g無水MgSO4、2.0 g NaCl混勻，渦旋振蕩5 min后于5000 r/min條件下離心5 min，移取1.5 mL上清液于裝有10 mg GCB、100 mg PSA、和150 mg無水MgSO4的2 mL離心管中，渦旋1 min，離心5 min，取上清液過0.22 μm的有機系濾膜，待測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，2.1 μm，流動相及梯度洗脫條件見表1。柱溫∶40 ℃；進樣量∶5 μL，自動進樣器進樣；進樣盤溫度∶10 ℃。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.3.2 質譜條件

電離源模式：電噴霧離子化(ESI)；離子源極性∶烯酰嗎啉、乙基多殺菌素、戊唑醇均為ESI+；霧化氣：氮氣；鞘氣流速：35 arb，輔助氣流速：10 arb；噴霧電壓：3 200 V；毛細管溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：330 ℃。3種農藥具體保留時間、檢測離子對、錐孔電壓和碰撞能量表等參數見表2。

表2 3種農藥的質譜參數

1.4 田間試驗樣品殘留檢測

參照NY/T 788-2018《農作物中農藥殘留試驗準則》，于2020年8月下旬在貴州省貴陽市息烽縣九莊鎮吊瓜種植基地進行烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇在吊瓜上的殘留試驗，吊瓜品種為越蔞3號。選取合適的種植地，將4株劃分為一個小區，共計8個小區，在6個小區各噴施20%烯酰嗎啉懸浮劑(900倍液)、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑(30 mL/667m2)和430 g/L戊唑醇懸浮劑(17 mL/667m2)各一次，每個藥劑設置2個平行，剩余2個小區設置為空白對照。待吊瓜成熟后，于收獲期采樣，按照1.2節的前處理方式和1.3節的儀器條件進行3種農藥的殘留檢測。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

在殘留檢測常用的提取劑有丙酮、甲醇和乙腈等，其中液相色譜法常用的提取劑以乙腈為主，而加入少量冰乙酸能使整體提取液偏弱酸性，提高烯酰嗎啉和戊唑醇的穩定性，同時降低提取的雜質，因此本試驗選擇了1%冰乙酸乙腈作為提取劑。

目前常用的樣品凈化劑有PSA、GCB，主要用于去除樣品中的油脂和色素等雜質，這恰好是吊瓜樣品中最主要的兩種雜質，而無水MgSO4則常用于去除樣品中的水分，因此本試驗將選擇PSA和GCB作為凈化劑。為了驗證其凈化效果，本試驗嘗試了3種凈化劑：凈化劑1 (100 mg PSA+150 mg無水MgSO4)、凈化劑2 (100 mg PSA+10 mg GCB)、凈化劑3 (100 mg PSA+150 mg無水MgSO4+10 mg GCB)。對空白樣品中進行添加水平為0.1 mg/kg的回收率檢測試驗(如表3)。結果發現，使用凈化劑1進行前處理時，乙基多殺菌素(-L)的回收率約為121%，使用凈化劑2進行前處理時，烯酰嗎啉的回收率約為68%，使用凈化劑3時，3種農藥的回收率均在80%～105%之間，符合NY/T 788-2018標準要求的回收率和相對標準偏差(RSD)，因此將使用凈化劑3(100 mg PSA+150 mg無水MgSO4+10 mg GCB)對后續試驗進行樣品前處理。

表3 3種凈化劑對3種農藥的平均添加回收率和相對標準偏差

2.2 線性范圍及基質效應

中國、日本、美國、歐盟、CAC等國家和機構暫沒有制定吊瓜上關于烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的農藥殘留最大限量(MRL)，根據歐盟規定的暫無MRL值的參考值(0.01 mg/kg)，本試驗將0.01 mg/kg作為參考MRL，分別配置0.001、0.005、0.01、0.05和0.1 mg/L等5個濃度的溶劑標溶液和基質標溶液，其中基質為空白樣品最終凈化的溶液。經過UPLC-MS/MS檢測后，分別以峰面積和濃度為縱坐標和橫坐標，擬合標準曲線，統計得到對應的線性回歸方程(表4)。結果表明，在0.001～0.1 mg/L的線性范圍內，3種農藥的線性關系良好，同時相關系數均大于0.99，故此條件能滿足檢測要求。

表4 3種農藥的線性范圍、線性方程、相關系數

質譜檢測中經常出現基質增強或減弱的基質效應，為提高檢測結果準確性，一般都會采用基質匹配標準曲線斜率和溶劑標準曲線斜率之比(K)來評價基質效應[12]。結果表明，3種農藥在吊瓜仁中基質效應在0.54～0.64之間，表現為中等基質抑制效應，為減少基質效應對檢測結果的影響，后續試驗將采用基質標曲線進行藥劑定量分析。

2.3 準確度與精密度

分別在空白吊瓜樣品中設置4個添加水平0.001、0.01、0.05和0.1 mg/kg的烯酰嗎啉、乙基多殺菌素、戊唑醇，每個添加水平5次重復。使用1.2節的前處理方式和1.3節的儀器條件進行檢測，根據檢測數據得到相應各濃度的平均回收率和RSD，詳細結果如表5。

表5 4個添加水平下3種農藥的平均添加回收率和相對標準偏差

結果表明，檢測結果均符合NY/T 788-2018標準要求的回收率和RSD。因此烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農藥的最低添加濃度即為其對應的定量限(LOQ)和檢出限(LOD)，即0.001 mg/kg，低于本試驗設定的參考MRL(0.01 mg/kg)，因此本試驗建立的檢測方法可運用于吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇的農藥殘留相關檢測。

2.4 實際樣品分析

采用本文的試驗方法對收獲期吊瓜樣品進行檢測。結果表明，在吊瓜上施用20%烯酰嗎啉懸浮劑、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和430 g/L戊唑醇懸浮劑后，僅戊唑醇有殘留檢出，檢出量約為0.002 mg/kg，其余兩種農藥在吊瓜瓜子仁上的殘留量均低于LOD(0.001mg/kg)。檢測結果證實：上述3種農藥在吊瓜上的殘留檢出量均低于歐盟規定的暫無MRL值的參考值(0.01 mg/kg)。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測吊瓜上烯酰嗎啉、乙基多殺菌素和戊唑醇3種農藥的檢測方法。該方法簡便、快速、高效，可廣泛運用在吊瓜中農藥殘留的相關研究中。通過對田間按照推薦劑量施用過20%烯酰嗎啉懸浮劑、60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑和430 g/L戊唑醇懸浮劑的吊瓜樣品進行殘留檢測發現，施藥后40 d采收的吊瓜瓜子仁農藥殘留檢測均未超過MRL值，可安全采收食用。