基于網絡藥理學探討肝積湯治療肝癌的分子機制

吳輝淵

（江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

根據國家癌癥中心2022年2月統計報告顯示，我國2016年新發肝癌38.9 萬例（約占總新發癌癥的9.6%），以肝癌為主要死因的病例數為33.6 萬例（約占癌癥總死亡數的13.9%），其發病率和死亡率在全部類別的惡性腫瘤中分別居第4 位與第2 位[1]。治療肝癌的主要手段包括外科手術、介入、靶向、免疫治療等，仍存在術后復發率高、生存期短、不良反應嚴重等問題[2～3]。中醫治療肝癌有獨特的療效和豐富的經驗[4～5]。肝積湯是醫院以柔肝、健脾、散結為治法的經驗方，前期臨床研究顯示肝積湯在中晚期肝癌患者的治療中取得了良好效果，能有效延緩肝癌進展，改善患者生存質量，延長生存期，但具體分子機制未明[6]。網絡藥理學是利用計算機生物分析軟件及數據庫，從分子水平上系統揭示中藥作用分子機制的方法[7]。其系統分析方法與中醫整體觀念下的辨證論治不謀而合。本研究擬采用網絡藥理學和生物信息學方法分析肝積湯治療肝癌的機制。現報道如下：

1 工具與方法

1.1 肝積湯活性成分及作用靶點篩選 將肝積湯的組成藥物柴胡、茯苓、夏枯草、茵陳、豬苓、女貞子、旱蓮草、白術、半夏、白芍、青蒿、山楂作為關鍵詞輸入TCMSP 數據庫，以OB≥30%并且DL≥0.18 為標準進行篩選，選取中藥活性成分和靶點蛋白。利用Uniprot 對獲取的靶點蛋白進行標準化處理，設置物種來源為“Human”，選擇“Reviewed”，得到與靶點蛋白相應的標準基因。

1.2 肝積湯治療肝癌的潛在靶點篩選 從GeneCards 數據庫以“hepatocellular carcinoma”為關鍵詞檢索肝癌相關靶點。設定Relevance Score≥10。利用Venny2.1.0 對肝積湯活性成分靶點和肝癌相關靶點取交集。得到肝積湯治療肝癌的潛在靶點。

1.3 PPI 拓撲分析 將1.2 得到的肝積湯治療肝癌的潛在靶點導入 String 數據庫中，設置為“Homo sapiens”，并且highest confidence≥0.40，其他設置為String 系統默認值，去除和其他蛋白無相互作用的蛋白，得到PPI 網絡模型。結果以TSV 格式保存，導入Cytoscape3.8.2 分析作圖，獲得這些靶點蛋白質相互作用網絡圖。利用Network Analyzer 進行拓撲分析，通過篩選Degree 前15 位基因為核心靶點。

1.4 GO 和KEGG 通路富集分析 基于R 軟件使用Bioconductor 生物信息軟件包以Pvalue＜0.05，Qvalue＜0.05 進行GO 與KEGG 分析，以條形圖或氣泡圖的形式展示結果。

1.5 繪制“成分-靶點-通路”網絡圖 將有效活性成分、作用靶點與KEGG 信號通路之間的關系導入Cytoscape3.8.2 軟件進行可視化展示，形成“成分-靶點-通路”網絡圖，使用Network Analyzer 計算Degree，藥物活性成分、靶點和KEGG 信號通路的Degree 越大越重要。

2 結果

2.1 肝積湯活性成分和靶點 在TCMSP 數據庫中以OB≥30%、DL≥0.18 為條件篩選肝積湯各成分，去除無預測靶點的中藥成分，得到中藥成分有夏枯草11個、白術7個、柴胡17個、茵陳13個、豬苓11個、茯苓15個、女貞子13個、旱蓮草10個、半夏13個、白芍13個、青蒿22個、山楂6個。將得到的中藥成分合并去重，最終得到80個化合物和249個靶點。

2.2 肝積湯治療肝癌的潛在靶點 通過GeneCards數據庫中檢索得到肝癌相關靶點885個。將肝積湯活性成分對應的249個靶點和肝癌相關的885個靶點合并去重，得到95個肝積湯治療肝癌的潛在靶點。見圖1。

圖1 韋恩圖

2.3 PPI 網絡構建 將95個潛在靶點導入String數據庫，并將結果導入Cytoscape 軟件進行可視化展示。見圖2。拓撲參數結果顯示：Degree 排前15 位的蛋白有TP53、血管內皮細胞生長因子A（VEGFA）、蛋白激酶B1（AKT1）、MYC、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB 抑制劑α（NFKBIA）、過氧化物合酶2（PTGS2）、FOS、BCL2L1、胱天蛋白酶8（CASP8）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子受體（EGFR）、趨化因子配體8（CXCL8）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），所有這些靶點的Degree 均超過平均值，這些蛋白很可能是肝積湯治療肝癌的核心靶點。

圖2 肝積湯治療肝癌PPI 靶點圖

2.4 肝積湯治療肝癌潛在靶點GO 富集分析 將潛在靶點經R 語言運行后GO 分析選取細胞組分（CC）、生物學過程（BP）和分子功能（MF）。GO 結果顯示，潛在靶點基因共富集至2 215 條生物過程通路中，37 條CC 表達過程中，128個與分子功能相關的過程中。以基因數（Genecount）排序，并選前10 條進行繪圖。結果顯示主要的BP 涉及細胞對化學應激的反應、細胞對氧化應激的反應、對脂多糖反應等；CC 主要涉及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白絡氨酸激酶等；MF 主要涉及DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合等。見圖3。

圖3 GO 富集分析

2.5 肝積湯治療肝癌的KEGG 通路分析 利用R語言運行潛在靶點，得到KEGG 通路159 條，以氣泡圖的形式展示前20 的結果，Pvalue 代表富集的顯著性，以顏色表示顯著性的高低，越紅顯著性越高。結果發現，與肝癌相關的通路上有顯著富集，如磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、乙型肝炎病毒信號通路、人巨細胞病毒（CMV）感染等信號通路。見圖4。

圖4 KEGG 通路分析

2.6 構建 “成分-靶點-通路網絡” 并分析 利用Cytoscape3.8.2 軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖，節點的拓撲參數使用Network Analyzer 功能進行分析。將KEGG 富集分析結果中排名前二十的通路及相關成分靶點導入Cytoscape 軟件中，繪制出“成分-靶點-通路”網絡圖。見圖5。圖中圓形代表通路，方形代表靶點，三角形代表成分，節點大小根據節點度值大小變化。圖中共165個節點，851 條邊，其中66個成分節點，20個通路節點，79個靶點節點。其中槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）Degree 值排名中藥成分前三，Degree 值分別為58、35、21。這3個成分涉及的靶點數目最多，很可能是肝積湯治療肝癌的主要活性物質，分別來自夏枯草、女貞子、柴胡、青蒿、墨旱蓮、山楂、白芍、茵陳。見圖6。這些成分同時又通過TP53、VEGFA、AKT1 等多個靶點，共同作用于PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎病毒信號通路、CMV 感染信號通路等多條信號通路。

圖5 “成分-靶點-通路”網絡圖

圖6 活性成分與中藥網絡圖

3 討論

通過運用網絡藥理學的研究方法，本研究探索了肝積湯治療肝癌患者可能的活性成分、靶點和通路。通過“成分-靶點-通路”網絡圖顯示，Degree 值排名靠前的中藥活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，這些成分可能是肝積湯治療肝癌的主要活性成分。槲皮素是廣泛存在自然界多種植物的黃酮類多酚物質，有抑制肝癌細胞生長[8]、抗癌細胞侵襲轉移[9]、抗血管生成[10]及化療增敏作用[11]，木犀草素、山柰酚同樣有抑制肝癌細胞增殖、誘導肝癌細胞凋亡、抗血管生成及化療增敏作用[12～16]。

通過構建PPI 網絡可知，TP53、VEGFA、AKT1可能是肝積湯方作用于肝癌最為關鍵的靶點。TP53作為一種多功能轉錄因子，大多數腫瘤發生了TP53基因突變，是目前常見的抑癌基因[17]。TP53 表達水平與肝癌患者總生存期相關，高表達患者預后差，無TP53 基因突變的肝癌患者預后好[18]。VEGFA 參與多種惡性腫瘤的侵襲、增殖和轉移過程，是目前最重要的促進血管生成的因子[19]。肝癌中VEGFA 高表達患者的無進展生存期、總生存期較VEGFA 低表達患者縮短[20]。中藥可下調VEGFA 的表達從而抑制血管生成[21]。

本研究KEGG 富集分析顯示，肝積湯治療肝癌主要涉及PI3K-Akt、乙型肝炎病毒、CMV 感染等信號通路。其中，PI3K-Akt 信號通路可促進細胞增殖和侵襲，對肝癌的發病和進展有著非常重要的作用，PI3K-Akt 信號通路受抑制后可以降低肝癌細胞遷移和侵襲[22]，PI3K-Akt 信號通路也可以被槲皮素抑制從而誘導肝癌細胞凋亡[23]。木犀草素可以通過PI3K-Akt 通路抑制促進細胞凋亡[24]。山柰酚抑制PI3K-Akt-ERK 等信號通路降低多種腫瘤的增殖和侵襲[25]。乙型肝炎病毒可以通過多個途徑導致肝癌的發生[26]，在我國大部分原發性肝癌患者既往有慢性乙肝病毒感染史，通過抑制慢性乙肝病毒，阻斷肝細胞癌變，成為原發性肝癌臨床治療的重要方法。CMV 感染可能是肝癌的主要危險因素，Faivre 等[27]發現CMV 血清陽性的肝癌患者更易出現遠處轉移，CMV 感染與肝細胞癌死亡率有一定關聯。

本研究發現的槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于TP53、VEGFA、AKT1 等靶點，通過PI3K-Akt、乙型肝炎病毒等通路發揮治療肝癌的作用，與目前該領域研究得出的結果有一定的相似性[28]。槲皮素、山柰酚等存在于多種中藥特別是治療肝癌的中藥處方中，具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫等多種藥理作用，目前研究較充分，從某種程度上也說明中藥治療肝癌在理論上的合理性和臨床上的有效性，同時也提示了網絡藥理學的局限性。前期臨床研究證明肝積湯臨床療效確切，安全性好。本研究發現肝積湯的作用機理復雜，有多種活性物質通過多個通路和靶點起效，這與中藥整體思路相符合。下一步將通過全面科學的實驗研究證實。