蒙藥阿嘎如-25 對小鼠肺纖維化的影響

賈 若 王永清 楊雨民 李艷華 蘇寶科 劉立新

1.內蒙古自治區中醫醫院急診科，內蒙古呼和浩特 010050；2.內蒙古自治區中醫醫院老年病科，內蒙古呼和浩特 010050

肺纖維化是一種以累及肺間質、肺泡和/或細支氣管為基本病變特點的疾病，有慢性進展性、致死性等特點，治療困難，預后極差，嚴重威脅了患者的健康[1-5]。研究證實，肺纖維化因過多細胞外基質沉積（extracellular matrix，ECM）而成。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是纖維化啟動和進程的關鍵因子[6-11]，Smad3 是TGF-β1 信號轉導中最重要的分子，可調節反向基因的轉錄[12-13]，TGF-β1/Smad 信號通路被激活，對肌成纖維細胞（myofibroblast，MB）的形成、肺泡上皮細胞與內皮細胞的間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）、ECM 的沉積均有重要影響[14]。纖維連接蛋白（fibronectin，FN），對于肺纖維化的發生發展起著非常重要的作用[15]，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）可促進TGF-β1 的活化，促進纖維化的進展[16]。本研究以TGF-β1/Smad3 信號通路為切入點，研究蒙藥阿嘎如-25 治療肺纖維化的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

主要試劑：TGF-β1（貨號：ER31210，HUABIO）；p-Smad3（貨號：ET1609-41，HUABIO）；FN（貨號：ET1702-25，HUABIO）；OPN（貨號：AF0227，Affinity）。

實驗藥物：博來霉素（bleomycin，BLM）（invitrogen，貨號：R250-1）；養陰益肺通絡丸（北京康益德中西醫結合肺科醫院，批號京藥制字：20100002）；吡非尼酮膠囊（北京康蒂尼藥業有限公司，生產批號：H2013376）；蒙藥阿嘎如-25（內蒙古自治區國際蒙醫醫院制劑中心）。

1.2 實驗動物

健康SPF 級雄性C57BL/6 小鼠72 只[斯貝福北京生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010，合格證號：110324200102508615]，平均體重（20±2）g，飼養于SPF 級屏障實驗室，飼養室溫度為22～25℃，濕度44%～49%，本研究經實驗動物倫理委員會審批（20190927-1）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立 隨機選取10 只健康SPF 級C57BL/6 小鼠作為正常組，其余62 只小鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）麻醉，管內注入BLM 稀釋液（按3.5 mg/kg劑量稀釋，溶劑為0.9%氯化鈉注射液）50 μl建立肺纖維化模型，確定肺間質纖維化及肺泡炎的程度參照文獻[12-13]的方法。

1.3.2 分組及給藥 造模后第28 天，死亡7 只，其余小鼠按隨機數字表法分為模型組（n=10）、西藥組（吡非尼酮膠囊）（n=9）、中藥組（養陰益肺通絡丸）（n=9），蒙高組（n=9）、蒙中組（n=9）、蒙低組（n=9）。

實驗藥物制備：蒙藥阿嘎如-25 屬于《蒙醫金匱》[17]經典名方，將其制成膠囊，每粒含生藥0.4 g。使用時將藥物烊化溶于其中。實驗動物灌胃給藥劑量按人鼠體表面積折算，配置濃度依次為13、6.5、3.25 mg/ml 溶液。吡非尼酮膠囊用超純水制成濃度為0.0046 mg/ml的混懸液。灌胃給予吡非尼酮膠囊10 mg/（kg·d），給藥體積均為1 ml/（100g·d）。按人日用臨床劑量0.5 mg/d 計算，經人小鼠體表面積比值折算成小鼠的日用藥量。模型及正常組給予等體積生理鹽水灌胃，各組每日固定時間灌胃，1 次/d，均灌胃8 周。

1.3.3 檢測方法 連續灌胃8 周后小鼠脫頸處死，取小鼠肺組織進行組織固定及冷凍處理。免疫組織化學染色及Masson 染色觀察小鼠肺組織病理改變及纖維化，Western blot 法檢測肺組織中TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表達，Tunel 法檢測細胞凋亡率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蒙藥阿嘎如-25 對小鼠肺組織病理形態及纖維化的影響

正常組小鼠肺組織結構基本正常，未見明顯病理改變。模型組肺組織結構嚴重破壞，支氣管上皮細胞部分脫落，部分肺泡萎縮，肺泡壁內可見大量紅細胞，組織中可見彌散性炎癥細胞浸潤（單核細胞為主）。蒙高組、蒙中組、蒙低組肺組織病理形態均較模型組改善明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織免疫組織化學染色（200×）

正常組肺組織無明顯的纖維蛋白沉積，而模型組藍染區域增多，小鼠肺泡壁的間質纖維化局灶性纖維組織增生，肺纖維程度進一步加強，各蒙藥組小鼠肺組織藍色區域較模型組明顯減少，肺纖維化程度明顯減輕。模型組膠原纖維面積百分比高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各蒙藥組膠原纖維面積百分比低于模型組，蒙高組膠原纖維面積百分比低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

圖2 各組小鼠肺組織Masson 染色（200×）

表1 各組小鼠肺組織纖維化情況比較（%，）

表1 各組小鼠肺組織纖維化情況比較（%，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05

2.2 蒙藥阿嘎如-25 對小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達的影響

模型組TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 表達高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各蒙藥組TGFβ1、p-Smad3、FN、OPN 表達均低于模型組，蒙高組低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達情況比較（）

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白表達情況比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05。TGF-β1：轉化生長因子-β1；FN：纖維連接蛋白；OPN：骨橋蛋白

圖3 各組小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad3、FN、OPN 蛋白的表達

2.3 蒙藥阿嘎如-25 對小鼠肺組織細胞凋亡的影響

模型組細胞凋亡率高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各蒙藥組細胞凋亡率低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；蒙高組細胞凋亡率低于其他蒙藥組，且蒙中組低于蒙低組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4、表3。

圖4 各組小鼠肺組織TUNEL 染色（400×）

表3 各組小鼠肺組織細胞凋亡情況比較（%，）

表3 各組小鼠肺組織細胞凋亡情況比較（%，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與蒙低組比較，cP＜0.05；與蒙中組比較，dP＜0.05

3 討論

研究證明，TGF-β1 可誘導一系列的信號轉導過程，實現其生物學效應，最終導致纖維化[18-20]。本研究顯示，蒙藥阿嘎如-25 可有效改善肺纖維化小鼠的肺組織病理改變及纖維蛋白沉積情況，抑制TGF-β1/Smad3 信號通路，抑制FN、OPN 蛋白的表達，減輕細胞凋亡，且其高劑量組效果更優，不失為治療肺纖維化的有效藥物。

蒙醫學說中，三根為生來固有的“赫依、希拉、巴達干”，維持機體達到“平衡狀態”，而五源學說以及寒熱屬性中，赫依因具有輕、糙、動為主秉性成分，歸屬氣源，呈寒熱兩重性[21-24]。赫依以循行之道遍布全身，上行赫依位于胸部，熱癥未痊愈殘留于肺，遷延時久，赫依偏盛紊亂，傷及肺體素，肺通氣受阻而致病。常有干咳，尤其在赫依時辰（拂曉前及夜幕降臨時）為著，無痰或咳少量泡沫痰，疲乏無力，快速活動后氣短，心悸，脈象空、芤，舌質紅、粗糙。治宜在強身潤肺，鎮赫依的前提下，以對癥治療為原則。蒙藥方劑阿嘎如-25（蒙藥名）[25]，主治：上下內外各種赫依病，尤其偏于清鎮內赫依病病證。對于上下內外各種赫依病均有裨益。

綜上所述，肺纖維化嚴重威脅著人們的健康，吡非尼酮價格昂貴，治療不易堅持，中藥和蒙藥較西藥都有價格便宜、容易堅持等特點，但蒙藥藥劑在本研究中體現了更好的治療效果，明確了蒙藥阿嘎如-25調控肺間質細胞干預促肺纖維化/抗肺纖維化耦聯治療肺纖維化的效應及分子途徑，構建“清鎮赫依（蒙藥阿嘎如-25）-順氣化痰（清鎮肺赫依）-抗肺纖維化（干預促肺纖維化/抗肺纖維化耦聯）”的藥效關系模型，為臨床治療提供了依據。