一株高產β-苯乙醇酵母的篩選、鑒定及其增殖培養條件優化

劉子睦，李娜，項馨瑤，薛鮮麗，2，王德培，3*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

β-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE），又名 2-苯乙醇。常溫下為無色、透明液體，具有令人愉悅的玫瑰香味[1]，屬于高級芳香醇，易溶于醇、酯、苯和醛等有機溶劑中。天然的β-苯乙醇主要存在于顯花植物的莖、葉及其提取的精油中，如玫瑰、茉莉、風信子等[2]。β-苯乙醇及其衍生酯（乙酸苯乙酯、丙酸-2-苯乙酯等）是重要的芳香物質，可作為食品添加劑，廣泛應用于食品和日化用品等生產領域[3]。而且以β-苯乙醇為底物合成的苯乙醇苷具有抗腫瘤、強心等作用，故在醫療領域有著重要應用[4-6]。近期有研究發現，β-苯乙醇的混合辛烷值質量高于現在使用的許多辛烷值促進劑，所以認為β-苯乙醇是一種理想的辛烷值促進劑[7]。

當前市場上的β-苯乙醇主要通過化學合成，化學合成過程中會產生多種雜質，使得無法達到食用及香料的質量標準[8-9]。通過植物萃取得到的β-苯乙醇安全無害，但植物所含β-苯乙醇濃度非常低，且提取生產周期長、成本昂貴[10]，遠遠不能滿足市場需求。微生物合成β-苯乙醇是歐洲食品管理局認可的“天然”方法[11]，是合成天然β-苯乙醇工業化新趨勢。

自然界中存在能夠合成β-苯乙醇的多種微生物。牛明福等[12]篩選得到一株馬克斯克魯維酵母，其β-苯乙醇產量可達到1.45 g/L。富志磊等[13]從酒曲中篩選得到一株耐高溫季也蒙畢赤酵母合成β-苯乙醇濃度為1.66 g/L。但微生物合成β-苯乙醇受到產物抑制，3 g/L的β-苯乙醇可以抑制大部分的微生物生長，是微生物發酵法合成β-苯乙醇的瓶頸[14]。

本研究從玉米胚芽粕和玉米皮、玉米淀粉渣等淀粉加工下腳料，及其廢料堆放的土壤中取樣篩選到一株可耐受高濃度β-苯乙醇的酵母菌株，通過優化其增殖培養條件獲得大量菌體以實現β-苯乙醇轉化發酵。為后期的研究與生產β-苯乙醇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米胚芽粕、玉米皮、玉米淀粉渣、土壤樣品：黑龍江金象生化有限責任公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化錳、硫酸銅（均為分析純）：天津市北方天醫試劑公司；β-苯乙醇（色譜純）、L-苯丙氨酸（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[15]：葡萄糖 20g/L、酵母粉 10 g/L、胰蛋白胨20 g/L。滅菌條件：115℃、20 min。

初篩培養基：葡萄糖10 g/L、酵母粉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、瓊脂20 g/L。滅菌條件：115℃、20 min。滅菌后加入終濃度達到2 g/L的β-苯乙醇。

復篩培養基：葡萄糖10 g/L、酵母粉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、瓊脂20 g/L。滅菌條件：115℃、20 min。滅菌后加入終濃度達到3.5 g/L的β-苯乙醇。

發酵培養基[13]：葡萄糖80 g/L、酵母粉5.5 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L。滅菌條件：115℃、20 min。滅菌后加入8 g/L的L-苯丙氨酸。

1.2 儀器與設備

752紫外可見分光光度計：天津市華偉科技有限公司；LRH-250-A生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司；AELTA320 pH計：梅特勒儀器（上海）有限公司；HYG恒溫培養振蕩器：上海欣蕊自動化設備有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離

分別稱取10 g的玉米胚芽粕和玉米皮、玉米淀粉渣、土壤樣品放入裝有100mL含2g/Lβ-苯乙醇無菌蒸餾水的錐形瓶（250mL）中，在180r/min，28℃的條件下，振蕩培養2 h。取樣品懸液，采用10倍梯度稀釋法[16]，從104、105稀釋倍數的菌液中吸取100 μL涂布在含有2 g/L β-苯乙醇的YEPD固體平板上（每個稀釋度涂兩個平板）。將涂布后的平板放在28℃的恒溫培養箱中培養20 h。

將實驗室現存的23株酵母菌分別在YEPD平板上活化，挑取單菌落于液體YEPD培養基中，在180r/min，28℃的條件下，振蕩培養20 h。采用10倍梯度稀釋法[16]，從 106、107稀釋倍數的菌液中吸取 100 μL 涂布在含有2 g/L β-苯乙醇的YEPD固體平板上（每個稀釋度涂兩個平板）。將涂布后的平板放在28℃的恒溫培養箱中培養20 h。將初篩中生長快、菌落直徑大的進行復篩，復篩將β-苯乙醇濃度提高到3.5 g/L，從中選擇長勢較好的菌株進行進一步分離純化。

1.3.2 酵母菌篩選

采用三區劃線的方法，將純化好的酵母菌株接種于含有4 g/L β-苯乙醇的YEPD固體平板上，在28℃的恒溫培養箱中培養60 h。每12 h觀察1次生長狀況，挑選長勢較好的菌株（YDF-1）進行保存。

1.3.3 酵母菌形態觀察及分子鑒定

菌落及細胞形態觀察：將篩選得到的酵母接種到YEPD平板上，在28℃條件下培養20 h，觀察其菌落形態[17]；挑取平板上菌落直徑較大的單菌落到YEPD液體培養基中，在28℃、180 r/min的條件下搖床振蕩培養20 h，在光學顯微鏡下觀察YDF-1菌落形態。

YDF-1的分子鑒定：18S rDNA序列的聚合酶鏈式反應擴增采用真菌通用引物為NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和 NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）[18]，擴增條件為 95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72 ℃ 90 s，30個循環，72℃，10 min。

1.3.4 β-苯乙醇標準曲線的繪制

取分析純級別的β-苯乙醇試劑，配制濃度為0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 g/L的標準品。采用高效液相色譜儀測定不同濃度標準品對應峰面積，并根據出峰面積繪制β-苯乙醇的標準曲線。

1.3.5 發酵液中β-苯乙醇含量的測定

取2mL發酵液，在8000r/min離心10min；取1mL上清液，用超純水稀釋10倍；用0.22 μm有機系濾膜過濾稀釋后的發酵上清液。高效液相色譜條件：C-18反相柱 4.6 mm×250 mm×5 μm； 流動相為甲醇∶水=1∶1（體積比），流速 1 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進樣量 10 μL。

1.3.6 增殖培養基優化

通過單因素試驗確定合適的碳源、氮源，然后通過正交試驗確定對應的碳源、氮源與磷酸氫二鉀的濃度。在此基礎上通過單因素試驗確定合適的金屬離子的種類與濃度，利用Design-Expert軟件設計Box-Benhenken試驗[19]并對試驗結果進行分析。

通過比較YDF-1在YEPD培養基中的生長曲線和優化后的培養基中的生長曲線，評價優化后的培養基[20]。

1.3.7 酵母轉化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇

以1.3.6中優化好的增殖培養基培養YDF-1，取40 mL發酵液，5 000 r/min離心15 min，收集菌體，轉接于轉化培養基中，培養48 h后，測得發酵液中β-苯乙醇含量。

1.3.8 酵母增殖菌體量的測定方法

比濁法：將發酵液稀釋一定倍數，在600 nm波長下測定OD值[21]。

稀釋微量活菌計數法：取100 μL菌液在1.5 mL離心管中進行梯度稀釋,最后將10 μL稀釋菌液點在平板上計數[22]。

1.4 數據分析

菌株測序結果通過Biodiet軟件處理后，在NCBI核酸系列數據庫中通過BLAST進行同源序列比對，再通過MEGA 7.0軟件進行系統分析并構建系統發育樹；通過IBM SPSS Statistics 25軟件對碳源、氮源及金屬鹽離子單因素試驗進行顯著性分析；通過Design-Expert軟件進行金屬鹽離子響應面試驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定

2.1.1 酵母菌分離

經過濃度為2.0 g/L β-苯乙醇的固體培養基初篩獲得24株酵母菌，經3.5 g/L β-苯乙醇的固體培養基復篩得到6株菌。分別為實驗室已有的Y322、Y714、YZM-1、RY7、RY3，以及從玉米胚原料中得到的酵母菌株YDF-1。

2.1.2 酵母菌篩選

60 h內，在4 g/L的β-苯乙醇的固體培養基上，只有YDF-1可以較好地生長。對YDF-1酵母菌株進行3輪分離純化，甘油管保藏。再進行分子生物學鑒定。

2.2 YDF-1形態學及分子鑒定

2.2.1 YDF-1形態學鑒定

YDF-1單菌落形態如圖1所示，YDF-1光學顯微鏡下形態如圖2所示。

圖1 YDF-1單菌落形態Fig.1 Single colony morphology of YDF-1

圖2 YDF-1光學顯微鏡下形態Fig.2 Morphology of YDF-1 under light microscope

由圖2可知，YDF-1在YEPD平板上28℃下培養24 h，菌落呈現圓形，初期邊緣整齊，72 h開始，邊緣有向外的假菌絲生成，菌落中間微微隆起，不透明呈乳白色。在YEPD液體培養基中28℃、180 r/min條件下培養20 h后，具有甜蘋果香味。在光學顯微鏡下觀察到的細胞形態：呈橢圓形或棒狀，一端或兩端芽殖。

2.2.2 YDF-1分子鑒定

YDF-1與相關菌株的18S rDNA進化樹見圖3。

圖3 YDF-1與相關菌株的18S rDNA進化樹Fig.3 18S rDNA evolutionary tree of YDF-1 and related strains

YDF-1測序得到的序列全長約為1 600 bp，通過BioEdit軟件處理后，在NCBI核酸系列數據庫中通過BLAST進行同源序列比對，下載相似性較高的酵母菌的相關序列。通過MEGA 7.0軟件進行系統分析并構建系統發育樹[23]。從進化樹結果中可得出，YDF-1屬于Pichia（畢赤酵母屬），與Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396（NG 063274.1）最為接近，相似性為99.88% 。

2.3 β-苯乙醇產量的測定

2.3.1 β-苯乙醇標準品的測定

β-苯乙醇濃度為0.5g/L標準品的高效液相色譜圖如圖4所示，β-苯乙醇出峰時間為8.087 min。

圖4 0.5 g/L β-苯乙醇標準樣品液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatography of 0.5 g/L β-phenylethanol standard sample

2.3.2 β-苯乙醇標準曲線的制備

以β-苯乙醇濃度為橫坐標，出峰面積為縱坐標繪制標準曲線結果見圖5。

圖5 β-苯乙醇標準品標準曲線Fig.5 β-Phenylethanol standard curve

由圖5中標準曲線得到方程：A=1 428.3×C+5.61，R2為 0.999 04。

2.3.3 YDF-1發酵產β-苯乙醇的測定

YDF-1發酵60 h后發酵液的色譜圖見圖6。

圖6 60 h發酵液液相色譜圖Fig.6 60 h liquid chromatogram of fermentation broth

由圖6可知，β-苯乙醇峰面積為409.2，將峰面積代入標準曲線中計算得苯乙醇濃度為2.83 g/L。說明YDF-1具有良好的發酵β-苯乙醇的潛力。

2.4 培養基及培養條件優化

2.4.1 碳源種類及濃度優化

碳源種類單因素結果見圖7。選取20 g/L～100 g/L碳源初始濃度，培養YDF-1，觀察其對YDF-1的增殖影響，結果見圖8。

圖7 不同碳源種類發酵液最終OD600值Fig.7 Final OD600value of fermentation broth of different carbon source species

圖8 不同葡萄糖濃度的最終發酵液OD600值Fig.8 OD600value of final fermentation broth with different glucose concentration

由圖7可知，6種碳源中果糖最合適YDF-1的生長，但葡萄糖作為自然界中分布最廣泛的單糖，在實際生產中較果糖成本低，且發酵后活菌數相差不顯著（P＞0.05），故選擇葡萄糖作為碳源。由圖8可知，菌體濃度隨葡萄糖濃度的增大而增大，而且葡萄糖濃度（80 g/L～100 g/L）較高時 YDF-1增殖效果不顯著（P＞0.05），因此選擇葡萄糖的最佳濃度為100 g/L。

2.4.2 氮源種類及濃度優化

氮源種類單因素試驗結果見圖9。

圖9 氮源種類與濃度單因素試驗結果Fig.9 Results of single factor experiments on nitrogen source species and concentration

由圖9可知，YDF-1對牛肉膏、胰蛋白胨和玉米漿的利用較好，當胰蛋白胨濃度為2 g/L時，可獲得最高的菌體量，所以選擇2 g/L的胰蛋白胨濃度作為最佳氮源。

2.4.3 碳源氮源與磷酸氫二鉀的正交試驗

根據單因素試驗結果，YDF-1在葡萄糖濃度為100 g/L時可獲得較高菌體量，且增幅較為平緩，所以選取80、100、120 g/L作為碳源水平選擇。YDF-1在胰蛋白胨濃度為2 g/L時可獲得較高菌體量，但增幅較大，所以選取2.0、2.5、3.0 g/L作為氮源水平選擇。因為磷酸二氫鉀在培養基中具有促進微生物生長繁殖的作用，且與葡萄糖和胰蛋白胨具有交互作用，所以選擇磷酸氫二鉀濃度作為第3個影響因子。選擇葡萄糖濃度（A）、胰蛋白胨濃度（B）、磷酸二氫鉀濃度（C）作為研究對象，設計三因素三水平正交試驗，因素水平設計見表1，試驗結果見表2。

表1 正交試驗設計因素水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experimental design

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

從表2可看出，胰蛋白胨濃度的改變對YDF-1菌體增殖的影響最大，葡萄糖濃度次之，磷酸氫二鉀濃度對畢赤酵母YDF-1菌體增殖的影響最小。根據表2的結果得最佳組合為A1B3C2，即葡萄糖濃度100 g/L、胰蛋白胨濃度3.0 g/L、磷酸二氫鉀濃度4.0 g/L。以A1B3C2的組合與正交組合中OD600值最高組（A3B3C2）組進行驗證比較。經驗證，A1B3C2組合的發酵液稀釋35倍測得OD600值為0.753，A3B3C2組合的發酵液稀釋35倍測得OD600值為0.732。故選擇最佳組合為葡萄糖濃度為100 g/L、胰蛋白胨濃度為3.0 g/L、磷酸二氫鉀濃度為4.0 g/L。

2.4.4 金屬離子種類及濃度的優化

金屬離子單因素試驗結果見圖10。

圖10 不同金屬離子種類的單因素試驗結果Fig.10 Single factor experimental results of different metal ion types

由圖10可知，與空白組相比，只有氯化錳、硫酸銅、硫酸鎂對菌體增殖有顯著促進（P＜0.05），硫酸銨、硫酸亞鐵、硝酸鈉、氯化鈣對菌體增殖無顯著性影響，而硫酸鋅可能對YDF-1生長有抑制作用。通過SPSS軟件分析，氯化錳、硫酸銅、硫酸鎂3種金屬離子均為顯著影響因子，選擇此3種進行后續的優化試驗。

3種金屬離子不同濃度單因素試驗結果見圖11。

圖11 不同金屬離子濃度的單因素試驗結果Fig.11 Single factor experimental results for different metal ion concentrations

從圖11中可看出酵母菌體量隨硫酸鎂與硫酸銅濃度增加先升高后下降，而添加氯化錳組的OD600值一直隨著金屬離子濃度的升高而降低。

根據上述的試驗結果，利用Design-Expert軟件設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表3與表4。

表3 Box-Behnken試驗設計水平及因素Table 3 Factor and levels of Box-Behnken experimental design

表4 Box-Behnken試驗結果Table 4 Box-Behnken experimental results

通過Design-Expert軟件對試驗數據進行多元回歸分析，可得到三元二次回歸擬合方程：OD600=0.734585+0.202 422A+0.593 750B+0.505 625C+0.281 25AC-0.209 766A2-1.191 67B2-2.69375C2。

表5為YDF-1金屬離子優化試驗結果的回歸系數顯著性檢驗。

表5 回歸系數顯著性檢驗Table 5 Test for significance of regression coefficients

從表5中可看出：所選用的模型極顯著（P=0.0002＜0.01），說明模型選擇合適，且經方差分析結果表明，該方程的決定系數為R2=0.969 4，校正決定系數AdjR2=0.929 9，說明該模型預測值與實測值擬合度較高，能解釋92.99% 的響應值的變化，因此可用此回歸方程對試驗結果進行分析預測。方程中一次項中A對結果影響顯著，C對結果有極顯著影響；二次項A2、B2、C2對結果均具有極顯著影響；交互項中只有AC對結果有顯著影響。

3個因子交互作用對OD600影響的響應曲圖見圖12。

圖12 硫酸鎂、硫酸銅和氯化錳濃度交互作用對OD600值的影響Fig.12 Effects of interaction levels of magnesium sulfate，copper sulfate and manganese chloride on OD600value

由圖12可知，通過二次多項數學模型解逆矩陣，得出最佳金屬離子濃度為硫酸鎂0.5 g/L、硫酸銅0.25 g/L、氯化錳0.142 g/L,其預測YDF-1發酵液稀釋35倍可獲得最大OD600值為0.89。經后續兩次驗證，YDF-1發酵液稀釋35倍測得OD600值分別為0.885與0.887，與預測值接近，所以可使用0.5 g/L的硫酸鎂、0.25 g/L的硫酸銅、0.142 g/L的氯化錳作為金屬離子最佳濃度。

2.5 生長曲線的測定

YDF-1的生長曲線見圖13。

圖13 YDF-1的生長曲線Fig.13 Growth curve of YDF-1

由圖13可知，YDF-1在普通YEPD培養基中，0～2 h為延滯期，2 h～6 h為對數生長期，6 h以后為穩定期，此時發酵液中活菌數為5.3×108CFU/ml。YDF-1在優化培養基中，0～2 h為生長延滯期，2 h～13 h為生長對數期，13 h以后為穩定期，在20 h時取樣，進行稀釋涂布活菌計數，此時發酵液中活菌數為1.39×109CFU/mL。相比較YEPD培養基，優化后OD600值（稀釋40倍）提高了2.4倍，活菌數提高了2.6倍。

2.6 增殖YDF-1轉化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇

將YDF-1在上述增殖培養基中培養至OD600（稀釋35倍）值高于0.85以上時，離心收集菌體，將菌體置于轉化培養基中培養48 h，測其發酵液中β-苯乙醇濃度，結果見圖14。

圖14 48 h發酵液液相色譜圖Fig.14 48 h liquid chromatogram of fermentation broth

由圖14可知，β-苯乙醇對應峰面積為478.7，計算得到苯乙醇濃度為3.27 g/L。說明經增殖培養后再進行L-苯丙氨酸轉化，可以有效地提高β-苯乙醇的產量。

3 結論

自然界中多種酵母都可以通過艾氏途徑轉化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇，但高濃度的β-苯乙醇會抑制酵母的生長，同時也有研究發現酵母對β-苯乙醇的耐受性越好，其轉化合成β-苯乙醇的能力越強。所以選育可耐受高濃度β-苯乙醇的酵母是高產β-苯乙醇的必備條件之一。而本試驗通過增殖培養實現了β-苯乙醇產量的增加，相比較傳統方法，這種方法在縮短了發酵周期的同時也提高了β-苯乙醇產量，為后續轉化合成β-苯乙醇的研究奠定了基礎，為應用生產天然β-苯乙醇提供了菌株來源。

本文從玉米胚芽、玉米皮等淀粉生產下腳料中分離出的酵母菌株YDF-1，通過形態、18S rDNA序列分析鑒定，確認其為Pichia kudriavzevii（庫德里阿茲威畢赤酵母）。經試驗證明，YDF-1可耐受4 g/L的苯乙醇濃度，初步發酵β-苯乙醇產量為2.82 g/L，具有高產β-苯乙醇的潛力。通過單因素和響應面試驗獲得YDF-1增殖培養最優化培養基：葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨 3 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO4·5H2O 0.5 g/L、CuSO40.25 g/L、MnCl20.142 g/L。培養20 h，每毫升發酵液中含有活菌1.39×109個。相比初始YEPD培養基，活菌數提高了2.6倍。以此優化條件增殖培養YDF-1后進行初步轉化試驗生產β-苯乙醇，培養48 h時β-苯乙醇產量可達3.27 g/L。