銀杏黃酮苷元對多柔比星治療肝癌的增效減毒作用Δ

宋忠軍，朱曉青，何艷，李勇軍，陸苑（1.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004；.貴州醫科大學附屬醫院臨床試驗研究中心，貴陽 550004；4.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴陽 550004）

銀杏葉提取物是從銀杏葉中提取的以黃酮類、萜內酯類等化合物為主要活性成分的天然藥物[1]。研究表明，銀杏葉提取物具有抗氧化、抗腫瘤、保護神經系統等藥理作用，被廣泛應用于心血管系統、神經系統、呼吸系統疾病和腫瘤的輔助治療[1]。銀杏黃酮苷元（ginkgo flavone aglycone，GA）是借助酶水解法除去銀杏葉提取物中黃酮苷的糖基所獲得的新型提取物，主要成分為槲皮素、山柰酚和異鼠李素[2]。與傳統的銀杏葉提取物相比，GA具有更高的生物利用度和更強的生物活性[3]。多柔比星（doxorubicin，DOX）又稱阿霉素，是臨床治療肝癌、淋巴瘤、乳腺癌等惡性腫瘤的一線化療藥物，但該藥具有明顯的心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制等毒副作用（尤以心臟毒性最為嚴重），且在治療過程中易誘發多藥耐藥，已成為目前腫瘤臨床治療難以克服的瓶頸[4-5]。

中藥對化療藥物的增效減毒作用是腫瘤治療研究的熱點之一[6]。相關研究表明，中藥的介入可明顯減少化療藥物所致不良反應，提高化療有效率，改善腫瘤患者的生存質量[7]。有研究表明，在腫瘤治療過程中，DOX的多藥耐藥性主要由P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）介導，而DOX與P-gp抑制劑聯合使用可增強DOX的抗腫瘤活性[8]。此外，DOX所致氧化損傷是其引發心臟毒性的主要原因[9]，而槲皮素、山柰酚和異鼠李素均具有抗腫瘤、抗氧化和保護心腦血管系統等多種藥理活性[10-13]，且三者都是P-gp抑制劑[14]。基于此，本課題組推測GA對DOX具有一定的增效減毒作用，故本研究以H22荷瘤小鼠為對象，初步探討GA的增效減毒作用，旨在為銀杏資源的深度開發利用及臨床抗肝癌聯合用藥方案的選擇提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）、800DH型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Eclipse E100型正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

GA（槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量分別為44.61%、44.23%、4.77%）由貴州省生化工程中心何珺副教授惠贈；鹽酸多柔比星原料藥（批號N1111A，純度＞98%）購自大連美倫生物技術有限公司；甲胎蛋白（alpha-fetal protein，AFP）檢測試劑盒（批號20210816）購自南京建成生物工程研究所；B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）、N末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-pro BNP）檢測試劑盒（批號分別為08/2021、08/2021）均購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗人血小板-內皮細胞黏附分子1（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，又名CD31）抗體（批號GB113151）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號GB23303）和蘇木精-伊紅（HE）染液、天狼星紅染液、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）、TUNEL試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

H22小鼠肝癌細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質量為16～20 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有小鼠均飼養于溫度18～25℃、相對濕度50%～70%的動物房內，自由攝食、飲水，適應性飼養1周開始后續實驗。本研究經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準，倫理批件號為NO2101200。

2 方法

2.1 細胞培養

將H22細胞接種于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，每2～3天傳代1次，共傳代2次。收集對數生長期細胞，經臺盼藍染色并待細胞存活率大于95%后，用PBS稀釋得1×107個/mL的細胞懸液，備用。

2.2 H22荷瘤小鼠模型建立

取“2.1”項下H22細胞懸液經2次腹水傳代后，用PBS稀釋，制成2×107個/mL的腫瘤細胞懸液。取上述腫瘤細胞懸液0.2 mL于小鼠右腋皮下單次接種，以接種后小鼠右腋出現肉眼可見瘤體為造模成功。

2.3 動物分組與給藥

造模成功后，將小鼠隨機分為模型對照組、DOX組、GA組、GA+DOX組，每組6只。模型對照組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.25 mL，DOX組小鼠隔天（即第1、3、5、7、9、11、13、15天）尾靜脈注射DOX藥液（以生理鹽水為溶劑）2.5 mg/kg，GA組小鼠每天灌胃GA混懸液（以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑）30 mg/kg，GA+DOX組小鼠每天灌胃GA混懸液30 mg/kg+隔天（同DOX組）尾靜脈注射DOX藥液2.5 mg/kg，連續給藥15 d。各藥物組劑量均依據本課題組前期預實驗結果設置。

2.4 小鼠一般生長狀況檢測

實驗期間，觀察各組小鼠的一般生長狀況，稱定其體質量并繪制體質量變化曲線；同時，計算各組小鼠的體質量變化百分比：體質量變化百分比（%）＝（最終體質量-最初體質量）/最初體質量×100%。

2.5 小鼠腫瘤組織生長情況檢測

治療期間，每2天測量并計算腫瘤體積（V）：V＝（a×b2）×0.5（式中，a為瘤體長度，b為瘤體寬度），同時繪制腫瘤生長曲線。末次給藥2 h后，于眼球取血并處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱取瘤體質量并計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（C-T）/C×100%（式中，C為模型對照組小鼠的平均瘤體質量，T為各藥物組小鼠的平均瘤體質量）。使用金氏公式來評估藥物聯合使用的效果（Q）：Q＝EGA+DOX/[EGA+（1-EGA）EDOX]（式中，EGA、EDOX和 EGA+DOX分別表示GA、DOX單藥及其聯合使用的抑瘤率）。當Q＜0.85時，表示兩藥作用拮抗；當Q為0.85～1.15時，表示兩藥作用相加；當Q＞1.15時，表示兩藥作用協同[15]。

2.6 小鼠血清AFP水平檢測

末次給藥后，取各組小鼠血樣，制備血清。取血清適量，采用酶聯免疫吸附測定法以酶標儀測定AFP水平，嚴格按照相應試劑盒說明書方法操作。

2.7 小鼠腫瘤組織病理觀察及細胞凋亡情況檢測

末次給藥后，取各組小鼠腫瘤組織適量，在4%甲醛溶液中固定72 h后，常規石蠟包埋、脫水、切片。取組織切片進行HE染色，觀察腫瘤組織病理改變情況并計算腫瘤組織壞死面積百分比：腫瘤組織壞死面積百分比（%）＝腫瘤組織壞死面積/腫瘤總面積×100%。同時，取組織切片進行TUNEL染色，觀察腫瘤組織中細胞的凋亡情況并分析凋亡陽性率：凋亡陽性率（%）＝凋亡陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.8 小鼠腫瘤組織中CD31表達水平檢測

采用免疫組化法進行檢測。取各組小鼠腫瘤組織適量，常規石蠟包埋、脫水、切片，切片脫蠟并經乙醇梯度水化、抗原修復后，用3%過氧化氫溶液孵育以阻斷內源性過氧化物酶；用3%牛血清白蛋白在室溫下孵育，加入CD31一抗（稀釋比例為1∶500），4℃孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例為1∶200），室溫孵育50 min，用PBS清洗3次，以DAB試劑顯色，經水洗、蘇木精復染、脫水、封片后，使用顯微鏡觀察并采集圖像（蘇木精染細胞核呈藍色，DAB染CD31陽性表達細胞呈棕黃色），通過分析蛋白表達陽性率來反映CD31蛋白的表達水平。

2.9 小鼠心臟病理改變及心肌纖維化情況檢測

末次給藥后，取各組小鼠心臟，用生理鹽水沖洗并用濾紙吸干，稱定心臟質量并計算心臟指數：心臟指數＝心臟質量/最終體質量。取心臟組織適量，于4%甲醛溶液中固定72 h后，常規石蠟包埋、脫水、切片。采用酶聯免疫吸附測定法以酶標儀檢測其血清BNP、NT-pro BNP水平，嚴格按照相應試劑盒說明書方法操作；取組織切片進行HE和天狼星紅染色，分別觀察其心臟病理改變和心肌纖維化情況。

2.1 0 統計學方法

3 結果

3.1 GA聯合DOX對小鼠一般生長狀況的影響

H22荷瘤小鼠的造模成功率為100%。實驗期間，各組小鼠飲食正常，除模型對照組和DOX組小鼠出現精神萎靡外，其余各組小鼠的精神狀況良好。

實驗期間，各組小鼠體質量均有所增加；與模型對照組比較，GA組小鼠體質量變化百分比無明顯變化（P＞0.05），DOX組小鼠體質量變化百分比顯著降低（P＜0.01），GA+DOX組上述指標介于DOX組和GA組之間，但仍顯著低于模型對照組（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組小鼠的體質量變化（±s，n＝6）

3.2 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織生長的影響

實驗期間，各組小鼠的腫瘤生長速度依次為：模型對照組＞GA組＞DOX組＞GA+DOX組。經過15 d的干預后，各藥物組小鼠的瘤體體積和質量（P＜0.01）均小于/低于模型對照組；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠的瘤體質量均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖2、表1。DOX組、GA組、GA+DOX組的抑瘤率分別為54.29%、42.50%和89.29%；GA與DOX聯用的Q為1.21，提示兩藥聯用表現為協同的抑瘤作用。

表1 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織生長和血清AFP水平的影響（±s，n＝6）

表1 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織生長和血清AFP水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型對照組比較，P＜0.01；b：與模型對照組比較，P＜0.05；c：與DOX組比較，P＜0.01

AFP/（ng/mL）3.34±0.19 2.77±0.12a 3.03±0.18b 2.63±0.18a組別模型對照組DOX組GA組GA+DOX組瘤體質量/g 2.80±0.25 1.28±0.09a 1.61±0.22a 0.30±0.05ac

圖2 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織生長的影響（±s，n＝6）

3.3 GA聯合DOX對小鼠血清AFP水平的影響

與模型對照組比較，各藥物組小鼠血清AFP水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠血清中AFP水平雖有所降低，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

3.4 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織病理學及細胞凋亡情況的影響

HE染色腫瘤組織病理學檢查結果見圖3。由圖3可知，模型對照組小鼠腫瘤組織中細胞數量較多，無明顯壞死細胞，細胞形態特征明顯，呈明顯的球形、梭形且有大核，表明組織內細胞處于快速增殖狀態。各藥物組小鼠腫瘤組織出現不同程度壞死，細胞分布不規則，胞核固縮、碎裂，其腫瘤組織壞死面積百分比均顯著高于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠腫瘤組織壞死面積雖有增大趨勢，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。腫瘤組織TUNEL染色結果見圖4。由圖4可知，與模型對照組比較，各藥物組小鼠腫瘤組織中的凋亡細胞均有所增多，且GA+DOX組小鼠腫瘤組織中細胞的凋亡陽性率均顯著高于模型對照組和DOX組（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠腫瘤組織病理改變情況（HE染色）及腫瘤組織壞死面積百分比

圖4 各組小鼠腫瘤組織中細胞凋亡情況（TUNEL染色）及細胞凋亡陽性率

3.5 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織中CD31表達水平的影響

與模型對照組比較，各藥物組小鼠腫瘤組織中CD31的表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組CD31的表達水平雖有降低趨勢，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖5。

圖5 GA聯合DOX對小鼠腫瘤組織中CD31表達水平的影響

3.6 GA聯合DOX對小鼠心臟病理改變及心肌纖維化情況的影響

與模型對照組比較，DOX組小鼠的心臟指數顯著降低（P＜0.05）；與DOX比較，GA組和GA+DOX組小鼠的心臟指數均有增加的趨勢，但組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。此外，與模型對照組比較，DOX組和GA+DOX組小鼠血清BNP、NT-pro BNP水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與DOX組比較，GA+DOX組小鼠血清BNP、NT-pro BNP水平雖有降低的趨勢，但組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2 GA聯合DOX對小鼠心臟指數和血清BNP、NT-pro BNP水平的影響（±s，n＝6）

表2 GA聯合DOX對小鼠心臟指數和血清BNP、NT-pro BNP水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型對照組比較，P＜0.05；b：與模型對照組比較，P＜0.01

組別模型對照組DOX組GA組GA+DOX組NT-pro BNP/（ng/L）1 229.29±70.21 1 437.36±33.85b 1 260.24±71.57 1 397.14±59.80b心臟指數/（mg/g）3.98±0.22 3.59±0.19a 4.39±0.36 3.79±0.19 BNP/（ng/L）93.46±5.97 110.03±9.67b 93.88±6.81 100.73±2.71a

小鼠心臟病理學觀察結果見圖6A。由圖6A可見，模型對照組和GA組小鼠心肌纖維束排列整齊，橫紋清晰，胞漿均勻，無空泡化，未見明顯組織病變；DOX組小鼠心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，胞漿不均勻，可見節段性凝聚及溶解，空泡化嚴重；GA+DOX組小鼠心肌排列尚整齊，橫紋尚清晰，心肌肌纖維斷裂、胞漿空泡化及溶解情況均較DOX組明顯減輕。這表明GA不會引起心臟組織病變，且可改善DOX所致的心臟組織病變。

小鼠心肌纖維化情況觀察結果見圖6B。由圖6B可見，模型對照組與GA組小鼠心肌纖維排列規則，纖維化染色（紅染）不明顯；DOX組小鼠心肌纖維排列紊亂，纖維化（紅染）嚴重；GA+DOX組小鼠心肌排列較規則，纖維化程度較DOX組明顯減輕。這表明GA不會引起心肌纖維化，且可改善DOX所致的心肌纖維化。

圖6 GA聯合DOX對小鼠心臟組織病理改變及心肌纖維化情況影響的顯微圖

4 討論

惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康及生命的疾病之一，2020年全球新增惡性腫瘤及死亡病例分別達到了1 930萬例和1 000萬例[16]。現有化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也會對正常細胞造成損傷，引發包括免疫抑制、神經/心臟毒性、骨髓抑制在內的諸多不良反應，這些嚴重的不良反應不僅會影響化療效果，而且會導致患者生存質量下降[17]。隨著中藥研究的不斷深入，越來越多的研究表明部分中藥成分具有抗腫瘤活性，與化療藥物聯用不僅可增強化療藥物的療效，還可降低后者的毒性和細胞耐藥的發生率[18]。有文獻報道，GA中的槲皮素、山柰酚、異鼠李素可通過阻滯細胞周期、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等多種途徑來發揮抗腫瘤作用[10-11，19]；此外，槲皮素還可通過抑制血管生成等途徑來發揮抗腫瘤作用[19]。基于此，本研究初步探討了GA與DOX聯合干預H22荷瘤小鼠的效果。

有研究指出，黃酮類化合物槲皮素、山柰酚、異鼠李素具有水溶性差、易被氧化、口服生物利用度低、體內半衰期短等缺點[20]。基于上述原因，大多動物實驗中這3個成分的給藥劑量較大，為50～200 mg/kg。本研究曾在預實驗中考察了30、60、100 mg/kg GA的抗腫瘤效果，結果顯示，其藥效隨著劑量的增加而增強。隨著納米粒、聚合物膠束、自微乳、前體脂質體等一系列藥物新劑型及制劑新技術的出現，中藥的開發與利用得以更進一步[21]。由于本課題組后期考慮采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米囊技術解決GA成藥性差這一問題，以提高其口服生物利用度、延長其體內生物半衰期、放大其藥理學效應，故本研究采用了具有藥效學活性的較低劑量（30 mg/kg）。結果顯示，GA組、DOX組和GA+DOX組小鼠體內腫瘤組織的生長均受到了不同程度的抑制，提示GA單用和與DOX聯用均表現出一定的抑瘤活性；同時，當GA與DOX聯用時，Q為1.21，提示兩者聯用具有協同抗腫瘤作用[15]。

癌癥標志物AFP是一種糖蛋白分子，是目前臨床診斷肝癌的常用血清腫瘤標志物，可用于原發性肝癌的診斷及療效評價[22]。細胞凋亡在腫瘤的形成與發展中起著至關重要的作用，細胞凋亡失衡不僅是腫瘤發生和進展的原因，也是腫瘤細胞對治療藥物耐藥的原因[23]。CD31是機體血管生成的重要標志物[24]。肝癌是一種血管依賴性惡性腫瘤，其生長和轉移與血管生成密切相關[25]。本研究結果顯示，各藥物組小鼠血清AFP水平和腫瘤組織中CD31的表達水平均較模型對照組顯著降低，且GA+DOX組上述指標均有低于DOX組的趨勢；同時，各藥物組小鼠的腫瘤組織壞死面積百分比和細胞凋亡陽性率均顯著高于模型對照組，且GA+DOX組的細胞凋亡陽性率顯著高于DOX組。這提示GA與DOX聯用可能通過抑制腫瘤血管因子CD31的表達來促進細胞凋亡，從而發揮協同抗肝癌的作用。

心臟毒性（如心力衰竭）是DOX常見的不良反應之一[4-5]。當心臟功能受損時，心臟指數會有所降低[9]。BNP和NT-pro BNP由BNP前體經裂解產生，當心臟功能受損時，兩者的血清水平將有所升高[26]。心肌纖維化是心血管疾病發展到一定階段的結果，是以正常心肌組織中細胞增殖、細胞外基質過度堆積為主要表現的疾病，是心力衰竭的重要病理因素[27]。本研究結果表明，給予DOX后，H22荷瘤小鼠的心臟指數顯著降低，血清BNP、NT-pro BNP水平均顯著升高，心臟組織病變及心肌纖維化程度嚴重；而GA與DOX的聯用對上述指標均有改善趨勢。

綜上所述，GA是一種有效的抗腫瘤天然提取物，具有一定的抑瘤作用，且與DOX聯合具有協同作用，可增加DOX的促細胞凋亡作用，并有助于減輕后者的心臟毒性。