地稔中6種成分含量測定及其與抗氧化活性的相關性分析Δ

劉 靜 ，明惠儀 ，麻秀萍 ，錢 松 ，楊 菁 ，4，吳登莉 ，郭江濤 ，4（.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽 55005；.織金縣人民醫院藥劑科，貴州畢節 5500；3.國家苗藥工程技術研究中心/貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴陽 55005；4.貴州中醫藥大學茶大健康食品開發研究中心，貴陽 55005）

地稔為野牡丹科植物地菍Melastoma dodecandrumLour.的新鮮或干燥全草，是貴州地區常用民族藥，具有清熱解毒、活血止血的功效，臨床常用于治療高熱、肺癰、水腫、帶下、產后腹痛、癰腫等癥[1]?，F代研究表明，地稔含有黃酮、有機酸、甾體及其苷、鞣質、多糖等多種化學成分，具有抗氧化、抗炎、止血、降脂、降血糖等作用[2-3]?！顿F州省中藥材、民族藥質量標準》中僅記載了地稔的性狀、鑒別、性味歸經等，尚無含量測定項目，不能有效評價其質量。已有文獻報道采用外標法測定地稔中沒食子酸、蘆丁、牡荊素、異牡荊素、鞣花酸等成分的含量[4-6]，但所報道的方法僅能同時測定1～2種成分，難以經濟、有效地評價地稔的質量，故建立同時測定地稔中多指標成分含量的方法很有必要。

一測多評（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法是以性質穩定且廉價易得的某個成分為內參物，建立該成分與其他成分的相對校正因子（fs/i）來計算待測成分含量的方法，可實現多個成分同時測定[7-8]。該方法既解決了對照品不穩定、價格昂貴等問題，也節約了工作時間，降低了含量測定成本[8]?；钚匝跏且幌盗袇⑴c人體病理和退行過程的代謝物，過量的活性氧會誘導器官及組織的自由基損傷，從而加速多種疾病的發展[9]。有研究表明，地稔可有效地清除氧自由基，發揮抗氧化作用[10]，但目前對其發揮抗氧化活性的有效成分尚不明確。本研究選擇地稔中6種含量相對較高的成分（包括酚酸類成分沒食子酸、原兒茶酸，黃酮類成分牡荊素、異牡荊素、蘆丁，鞣質類成分鞣花酸）為對象，建立QAMS法同時測定其含量，并分析上述6種成分含量與抗氧化活性的相關性，旨在為地稔的質量分析及控制提供準確、可行、經濟的評價方法。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1290 InfinityⅡ系列超高效液相色譜（UPLC）儀（美國Agilent公司）、MS205DU型十萬分之一電子天平（美國Mettler Toledo公司）、FA2204N型萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）、1530型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號110831-201906，純度91.5%）、原兒茶酸對照品（批號110809-201906，純度97.7%）、牡荊素對照品（批號111687-201704，純度94.9%）、鞣花酸對照品（批號111959-201903，純度88.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；蘆丁對照品（批號C100001-200628，純度98.0%）和異牡荊素對照品（批號C101499-201219，純度98.00%）均購自貴州迪大生物科技有限責任公司；甲醇（色譜純）購自美國Tedia公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

23批地稔藥材采集于貴州、廣東、廣西、湖南、浙江等地，由貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定均為野牡丹科植物地菍M.dodecandrumLour.的全草。地稔藥材來源信息見表1。

表1 地稔藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Waters ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液為流動相A、甲醇為流動相B進行洗脫梯度（0～4 min，3%B；4～6 min，3%B～5%B；6～18 min，5%B～10%B；18～23 min，10%B～25%B；23～27 min，25%B～30%B；27～42 min，30%B～35%B；42～44 min，35%B；44～48 min，35%B～40%B；48～50 min，40%B～50%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為260 nm；進樣體積為0.8 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對照品各適量，加甲醇溶解，分別制成質量濃度為0.361、0.314、0.325、0.400、0.454 mg/mL的單一對照品溶液。另精密稱取鞣花酸對照品適量，加入二甲基亞砜2 mL使溶解，再以甲醇稀釋制成0.165 mg/mL的鞣花酸對照品溶液。取上述6種單一對照品溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取地稔粉末（過2號篩）1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，85℃水浴回流提取1 h，取出放冷，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性考察 分別精密量取空白溶劑（75%甲醇）、混合對照品溶液、供試品溶液各0.8 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，空白溶劑對6種待測成分的檢測無干擾，方法專屬性好。色譜圖見圖1（空白溶劑圖略）。

圖1 地稔中6種待測成分的UPLC圖

2.3.2 線性范圍考察 精密吸取“2.2.1”項下各單一對照品溶液各適量，加甲醇稀釋制成6個不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以各待測對照品的質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸。結果見表2。

表2 地稔中6種待測成分的線性關系考察結果

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下線性范圍下限濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.36%、0.28%、0.64%、0.29%、0.20%、0.69%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液（編號DR23），分別于室溫放置2、4、6、8、10、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.27%、0.38%、0.56%、0.60%、0.29%、2.96%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批地稔藥材（編號DR23）6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計算各成分的含量。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸含量的RSD分別為2.06%、1.64%、1.57%、2.36%、2.93%、2.49%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取同一批地稔藥材（編號DR23）6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入與地稔中各成分含量相當的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的平均加樣回收率分別為 97.79%、100.18%、97.84%、96.45%、91.84%、108.06%，RSD分別為1.71%、2.32%、1.41%、1.48%、1.20%、6.66%（n＝6），表明該方法準確度較好。

2.4 QAMS法的建立

2.4.1fs/i的計算 分別精密吸取“2.3.2”項下的系列混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各成分的峰面積。以牡荊素為內參物，采用多點校正法計算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的fs/i：fs/i＝（As×ci）/（cs×Ai）（As為內參物的峰面積，ci為待測成分的質量濃度，cs為內參物的質量濃度，Ai為待測成分的峰面積）[11]。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的fs/i分別為0.255、0.140、1.038、0.654、0.070，RSD分別為1.46%、1.18%、2.51%、0.91%、3.28%（n＝6）。

2.4.2 不同色譜柱、柱溫和流速對fs/i的影響 采用Agilent 1290 InfinityⅡ系列UPLC儀，考察不同色譜柱（Waters ACQUITY UPLC HSS T3、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、Agilent ZORBAX Stable Bond SB-C18，規格均為 2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.18、0.20、0.22 mL/min）對各成分fs/i的影響。結果顯示，在不同色譜柱、柱溫和流速下，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的平均fs/i分別為0.259、0.141、1.061、0.616、0.076，RSD 分別為 0.72%、0.83%、0.73%、1.07%、1.48%（n＝9），表明不同色譜柱、柱溫和流速對5種待測成分的fs/i無明顯影響。

2.4.3 不同色譜柱、柱溫和流速對相對保留時間和相對保留時間差的影響 以牡荊素為內參物，計算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的相對保留時間和相對保留時間差，考察“2.4.2”項下不同色譜柱、柱溫、流速對相對保留時間和相對保留時間差的影響。結果顯示，5種成分的平均相對保留時間分別為0.175、0.336、1.092、1.166、1.215，RSD分別為10.27%、7.27%、0.96%、1.40%、1.99%（n＝9）；平均相對保留時間差分別為-25.628、-31.860、3.546、6.439、8.344，RSD 分 別 為1.70%、1.89%、13.95%、12.76%、13.77%?？梢姡惸登G素、蘆丁、鞣花酸均可利用相對保留時間值法進行準確定位。由于沒食子酸和原兒茶酸的相對保留時間偏小，其相對保留時間的RSD均大于5%，利用相對保留時間值法對沒食子酸和原兒茶酸準確定位較為困難；而二者相對保留時間差的RSD均小于5%，表明二者可利用相對保留時間差值法進行準確定位，此外還可結合二者的紫外吸收特征對色譜峰進行定位。

2.5 地稔中6種成分含量的測定

取23批地稔藥材，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以牡荊素為內參物，通過fs/i分別計算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的含量，同時采用外標法計算沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的含量。采用SPSS 25.0軟件對外標法與QAMS法的含量測定結果進行獨立樣本t檢驗。平行2份操作，取平均值，結果見表3。

表3 23批地稔藥材中6種成分外標法與QAMS法的含量測定結果（n＝2，%%）

2.6 地稔抗氧化活性的測定

2.6.1 DPPH自由基清除法 參考文獻[12]的方法制備1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）工作液。取“2.2.2”項下供試品溶液，用75%甲醇稀釋200倍，得到生藥質量濃度為0.2 mg/mL的供試品溶液。將96孔板分為空白組、樣品組、對照組，每組設置4個平行樣。空白組加入75%甲醇溶液100 μL+DPPH工作液100 μL，樣品組加入供試品溶液100 μL+DPPH工作液100 μL，對照組加入供試品溶液100 μL+75%甲醇100 μL。3組樣品均于室溫下避光靜置20 min，在517 nm波長下測定吸光度，依次記為A0（空白組）、A1（樣品組）和A2（對照組）。按下式計算自由基清除率：自由基清除率＝[1-（A1-A2）/A0]×100%。結果見表4。

表4 23批地稔藥材的抗氧化活性測定結果（n＝4）

2.6.2 ABTS自由基清除法 參考文獻[12]的方法制備2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）法工作液。取“2.2.2”項下供試品溶液，用75%甲醇稀釋100倍，得到生藥質量濃度為0.4 mg/mL的供試品溶液。將96孔板分為空白組、樣品組、對照組，每組設置4個平行樣。空白組加入75%甲醇溶液20 μL+ABTS工作液180 μL，樣品組加入供試品溶液20 μL+ABTS工作液180 μL，對照組加入供試品溶液20 μL+水180 μL。3組樣品均于室溫下避光靜置30 min，在734 nm波長下測定吸光度，依次記為A0（空白組）、A1（樣品組）和A2（對照組）。按“2.6.1”項下公式計算ABTS自由基清除率。結果見表4。

2.6.3 FRAP法 參考文獻[13]的方法制備鐵離子還原/抗 氧 化 能 力（ferric ion reducing/antioxidant power，FRAP）工作液。將96孔板分為樣品組和空白組，每組設置4個平行樣。樣品組加入“2.6.2”項下生藥質量濃度為0.4 mg/mL的供試品溶液20 μL+FRAP工作液180 μL，空白組加入75%甲醇20 μL+FRAP工作液180 μL。2組樣品均于37℃下靜置10 min，在593 nm波長下測定吸光度，分別記為Ai（樣品組）、Aj（空白組）。另分別配制濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmoL/L的硫酸亞鐵溶液，按上述方法測定吸光度后繪制標準曲線。將供試品溶液的吸光度（Ai-Aj）代入標準曲線方程計算對應的硫酸亞鐵濃度，記為“FRAP值”。結果見表4。

2.7 6種成分的含量與抗氧化活性的相關性分析

2.7.1 灰色關聯度分析 采用Excel 2010軟件，對23批地稔藥材中6種成分的含量與抗氧化活性進行灰色關聯度分析。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸含量與抗氧化活性的關聯系數均大于0.6，表明關聯度較高[13]。6種成分對DPPH自由基清除率貢獻大小順序為異牡荊素＞鞣花酸＞牡荊素＞蘆?。驹瓋翰杷幔緵]食子酸，對ABTS自由基清除率貢獻大小順序為異牡荊素＞蘆?。灸登G素＞鞣花酸＞原兒茶酸＞沒食子酸，對FRAP值貢獻大小順序為異牡荊素＞牡荊素＞蘆丁＞鞣花酸＞原兒茶酸＞沒食子酸。結果見表5。

表5 地稔中6種成分含量與抗氧化活性的灰色關聯系數

2.7.2 雙變量相關性分析 采用SPSS 25.0軟件進行雙變量相關性分析。結果顯示，牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量與DPPH自由基清除率呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01），原兒茶酸含量與DPPH自由基清除率呈顯著負相關（P＜0.05）。在ABTS自由基清除率和FRAP值分析中，牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量與抗氧化活性呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01），沒食子酸、原兒茶酸含量與抗氧化活性呈顯著負相關（P＜0.05）。結果見表6。

表6 地稔中6種成分含量與抗氧化活性的雙變量相關系數

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件及檢測波長的篩選

本研究預實驗對供試品溶液的制備條件[提取方式（回流、超聲）和甲醇體積分數（25%、50%、75%、100%）]進行了比較，并對不同檢測波長進行了考察。以6種成分的提取率為指標，綜合優選采用75%甲醇回流提取制備供試品溶液。6種成分在254 nm和260 nm波長下均有較大吸收，牡荊素和異牡荊素在260 nm波長下較254 nm波長下響應值高，因此選擇檢測波長為260 nm。

3.2 混合對照品溶液穩定性的考察

本研究預實驗考察了混合對照品溶液在5 d和2、3個月內的穩定性。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁溶液放置3個月的fs/i的RSD均小于3.00%，表明穩定性較好；鞣花酸溶液在上述3個時間段的fs/i的RSD分別為2.36%、3.70%、7.00%，表明穩定性相對較差。由于鞣花酸同時含有親脂結構（4個環）和親水結構（4個酚基和2個內酯環），導致其親水性及親脂性均較差，微溶于水和醇，溶于二甲基亞砜，故制備鞣花酸對照品溶液時需加適量二甲基亞砜助溶[14]。本研究還發現，鞣花酸的fs/i會隨放置時間延長而增大，故不宜保存過久，盡量在5 d內測定。

3.3 地稔中6種成分的抗氧化活性分析

酚類化合物中羥基的數量、位置、相關的糖基化以及其他取代基在很大程度上決定了其自由基清除活性，其中鄰二羥基是所有酚類化合物顯示出高活性最重要的結構特征[15]。黃酮類化合物骨架中2，3-雙鍵、4-酮基、3′，4′-鄰二酚羥基和C-3位羥基結構對抗氧化活性起重要作用[16-17]。已有研究報道，鞣花酸、沒食子酸對地稔抗氧化活性貢獻顯著，原因可能與其含量及結構中鄰二酚羥基有關[3]?；疑P聯度分析結果顯示，6種成分的含量與抗氧化活性均有較高關聯度，其中異牡荊素與抗氧化活性關聯度最高，沒食子酸與抗氧化活性關聯度最低；雙變量相關性分析結果顯示，蘆丁與抗氧化活性相關性最顯著，而鞣花酸與抗氧化活性無顯著相關性。這一結果差異可能是因為制備的地稔供試品溶液未經水解，致使沒食子酸含量偏低，而鞣花酸理化性質特殊，單純使用75%甲醇提取率較低所致。

綜上所述，本研究成功建立了QAMS法同時測定地稔中6種成分的含量，測定結果與外標法無顯著差異；地稔中6種成分與抗氧化活性均有較高相關性。