茶芎HPLC指紋圖譜的建立及差異性成分的含量測定Δ

龔偉偉，羅光明，秦倩，曾金祥，徐蔥蘢，劉明貴，張壽文#（.江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004；.江西景德中藥股份有限公司，江西九江 33000）

傘形科植物茶芎Ligusticum sinenseOliv.cv.Chaxiong為一年生草本植物，以根莖入藥，主產于我國江西武寧、瑞昌、德安等地。據《江西省中藥材標準》記載，茶芎味辛、性溫，歸肝、心經，有活血行氣、祛風止痛的功效，可用于月經不調、痛經、閉經、產后瘀阻腹痛、胸脅刺痛、頭痛、風濕痹痛等[1]。現代研究表明，茶芎主要含有苯酞類、有機酸類、多糖類、氨基酸類和揮發油等成分。其中，苯酞類物質包括洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯A和藁本內酯等，均有較好的抗炎、鎮痛作用，尤以藁本內酯的作用最為顯著；有機酸類物質包括綠原酸、阿魏酸等，綠原酸可調節機體物質代謝、降低膽固醇，還具有抗氧化、抗菌作用，阿魏酸有抗血栓形成、促進血管舒張、延緩動脈粥樣硬化的作用[2-6]。可見，上述成分可能是茶芎的活性成分。

目前，關于中藥質量評價和質量控制研究多集中于單一或少數成分的定量分析，難以全面、客觀地對藥材進行評價，因此需要建立全面、有效的質量評價方法。中藥指紋圖譜能快速反映其化學成分信息，定性判斷其真實性；多元統計分析[聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）]可對已有的化學成分信息進行定量評價[7-10]。可見，中藥指紋圖譜與多元統計分析相結合，可全面、有效地對藥材進行質量評價和質量控制。基于此，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立12批茶芎藥材的指紋圖譜并進行相似度分析；同時，擬采用CA、PCA、OPLS-DA法對所得圖譜信息進行分析，篩選影響藥材質量的差異性成分并對其進行含量測定，旨在為全面進行茶芎質量評價和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括LC-20AT型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、LT-DHC160型高速離心機[立德泰勀（上海）科學儀器有限公司]、KQ-200KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、MS205DU型電子分析天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

E-藁本內酯對照品（批號Z812557，純度≥98%）購自上海楷森生物科技有限公司；綠原酸對照品（批號327-97-9，純度≥98%）、阿魏酸松柏酯對照品（批號63644-62-2，純度≥98%）、洋川芎內酯A對照品（批號Y08301903021，純度≥98%）、洋川芎內酯Ⅰ對照品（批號Y08501904030，純度≥98%）、Z-藁本內酯對照品（批號PCS-201104，純度≥98%）均購自北京中科質檢生物技術有限公司；阿魏酸對照品（批號110773-201915，純度≥99.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，水為超純水。

12批茶芎藥材分別采自江西武寧、瑞昌、德安的3個中藥基地，經江西中醫藥大學藥學院付小梅教授鑒定均為茶芎L.sinenseOliv.cv.Chaxiong的成熟根莖。將所采藥材放至55℃烘箱中烘干，粉碎，過四號篩，密封保存，備用。12批茶芎藥材樣品的來源信息見表1。

表1 12批茶芎藥材樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 茶芎藥材HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件以Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，10%B→15%B；10～13 min，15%B；13～23 min，15%B→20%B；23～26 min，20%B；26～36 min，20%B→30%B；36～39 min，30%B；39～47 min，30%B→40%B；47～53 min，40%B→55%B；53～60 min，55%B→65%B；60～75 min，65%B）；檢測波長為280 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；檢測平衡時間為20 min。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯A、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、E-藁本內酯、Z-藁本內酯對照品各適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，即得各單一對照品貯備液。分別取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇定容，制成上述成分質量濃度分別為56.3、42.5、40.5、53.9、33.7、23.1、96.1 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取茶芎樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，以13 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取茶芎樣品（編號S1）粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以Z-藁本內酯（峰形、分離度均較好且響應較強，下同）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取茶芎樣品（編號S1）粉末6份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以Z-藁本內酯為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 取茶芎樣品（編號S1）粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以Z-藁本內酯為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），說明該供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立 取12批茶芎樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄HPLC圖并以“AIA”格式導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》。以S7樣品圖譜（所含色譜信息豐富且各共有峰的分離度均較好）為參照，經多點校正、Mark峰匹配后，生成茶芎HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），詳見圖1。

圖1 12批茶芎樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.1.8 共有峰的確定及指認 采用Mark峰匹配，共得到17個共有峰。通過查閱相關文獻[11-12]并比對混合對照品色譜圖（圖2），初步確定1號峰為綠原酸、2號峰為阿魏酸、7號峰為洋川芎內酯Ⅰ、9號峰為阿魏酸松柏酯、13號峰為E-藁本內酯、14號峰為洋川芎內酯A、17號峰為Z-藁本內酯。

圖2 混合對照品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評價 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以對照指紋圖譜為參照，對12批茶芎樣品進行相似度評價。結果顯示，S1～S12批樣品與對照指紋圖譜的相似度分別為0.997、1.000、0.999、0.997、0.998、0.998、1.000、0.998、0.989、0.989、0.991、0.990，均大于0.980，提示不同產地茶芎樣品的相似性較好，質量相對穩定。其中，武寧茶芎（S1～S5）的相似度為0.997～1.000，瑞昌茶芎（S6～S8）的相似度為0.998～1.000，德安茶芎（S9～S12）的相似度為0.989～0.991。整體上，武寧茶芎（S1～S5）與瑞昌茶芎（S6～S8）的相似度接近，提示兩者化學成分相似；此外，武寧、瑞昌茶芎的相似度均稍高于德安茶芎（S9～S12），提示德安茶芎的化學成分可能與前兩者有所不同。

2.2 茶芎樣品的CA

本研究以12批茶芎樣品17個共有峰的絕對峰面積為變量，使用SPSS 22.0軟件進行Z-score標準化處理后，采用平方歐氏距離為測度，以組間連接法進行CA，結果見圖3。由圖3可知，當平方歐氏距離為20時，12批茶芎樣品可被分為3類，S1～S5（武寧茶芎）聚為一類，S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類。由此可以看出，不同產地茶芎樣品具有較明顯的聚類趨勢。當平方歐氏距離為24時，S1～S5（武寧茶芎）可與S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類，與茶芎HPLC指紋圖譜相似度評價結果基本一致。

圖3 12批茶芎樣品的CA樹狀圖

2.3 茶芎樣品的PCA

本研究以12批茶芎樣品17個共有峰的絕對峰面積為變量，采用SPSS 22.0軟件，在進行KMO、Bartlett’s檢驗和降維統計的基礎上進行PCA，其總方差解釋結果見表2。由表2可知，本研究共提取了4個主成分，累計方差貢獻率為85.385%（＞85%），提示前4個主成分代表了85.385%的整體信息，可用于反映不同產地茶芎樣品的整體質量。

表2 總方差解釋結果

由因子矩陣和權重系數分析可知，主成分1的信息主要來自2、8、10、12、13、16號峰，主成分2的信息主要來自11、14、15、17號峰，主成分3的信息主要來自3、4、6、7號峰，主成分4的信息主要來自1、5、9號峰。對各因子進行標準化處理，結合上述因子矩陣及權重系數，得到反映茶芎樣品質量的主成分得分（F1～F4）表達式：

隨后，對F1～F4進行系數加權（加權系數為特征值與累計特征值之和的比值），得到綜合評分（Fz）的表達式：

綜合評分越高，表示該批樣品整體質量越優[13-14]。根據上述公式，對12批不同產地茶芎樣品的質量進行評價，結果見表3。由表3可知，瑞昌茶芎（S6～S8）質量較好，其次為武寧茶芎（S1～S5）和德安茶芎（S9～S12）。

表3 主成分綜合評分及排序

2.4 茶芎樣品的OPLS-DA

本研究以12批茶芎樣品17個共有峰的絕對峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件進行OPLS-DA。結果顯示，X軸方向的模型解釋率（R2X）為0.945，Y軸方向的模型解釋率（R2Y）為0.987（R2X、R2Y越接近1，表明模型的穩定性越強[15-16]），模型的預測率（Q2）為0.966（Q2越接近1，表明模型的可預測性越強[15-16]）。隨機排列200次進行置換檢驗驗證，判斷OPLS-DA模型有無過度擬合現象。結果顯示，所得模型的R2截距為0.274，Q2截距為-1.290，提示所建模型不存在過度擬合現象[15-16]，可用以有效區分不同產地的茶芎樣品。由OPLS-DA得分圖（圖4）可知，武寧茶芎（S1～S5）聚為一類，瑞昌茶芎（S6～S8）聚為一類，均分布在得分圖右側；德安茶芎（S9～S12）聚為一類，分布在得分圖左側，該結果與相似度評價、CA結果基本一致，可相互佐證。

圖4 OPLS-DA得分圖

進一步對OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）進行分析，篩選影響樣品質量的差異性成分。以VIP＞1為篩選標準[16]，共得到貢獻相對較大的4個差異性成分，依次為17號峰（Z-藁本內酯，VIP為3.174）、14號峰（洋川芎內酯A，VIP為1.195）、2號峰（阿魏酸，VIP為1.150）、13號峰（E-藁本內酯，VIP為1.052）。結果見圖5。

圖5 共有峰的VIP圖

2.5 4種差異性成分的含量測定

采用HPLC法對“2.4”項下所得4種差異性成分（阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯）的含量進行測定。

2.5.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 取阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯4種對照品各適量，按“2.1.2”項下方法制備各單一對照品貯備液。取上述各單一對照品貯備液適量，按“2.1.2”項下方法制成上述成分質量濃度分別為1.84、1.96、1.68、2.98 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.5.4 專屬性試驗 取“2.5.2”項下混合對照品溶液、“2.5.3”項下供試品溶液和空白對照溶液（70%甲醇），按“2.5.1”項下色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖（圖略）。結果顯示，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯色譜峰的分離度均大于1.5，且各色譜峰無拖尾現象，提示方法專屬性良好。

2.5.5 線性范圍考察 取“2.5.2”項下阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯混合對照品溶液0.1、0.5、1、2、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表4。分別取阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯混合對照品溶液（質量濃度分別為0.018、0.020、0.017、0.030 mg/mL，按“2.5.2”項下方法配制）適量，以70%甲醇倍比稀釋，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比3∶1、10∶1計算檢測限和定量限，結果見表4。

表4 4種成分的線性關系考察結果

2.5.6 精密度試驗 取“2.5.3”項下供試品溶液（編號S1），按“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯峰面積的RSD分別為0.12%、0.54%、0.98%、0.42%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.5.7 重復性試驗 取同一批茶芎樣品（編號S1）6份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結果顯示，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯含量的RSD分別為0.93%、1.38%、1.45%、1.12%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.5.8 穩定性試驗 取“2.5.3”項下同一供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯峰面積的RSD分別為0.18%、0.17%、0.50%、0.25（n＝6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（編號S4）6份，每份約0.25 g，置具塞錐形瓶中，加入與已知量相當的阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯對照品溶液（按“2.5.2”項下方法配制），按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯的平均加樣回收率分別為99.92%、98.01%、100.90%、99.73%，RSD分別為0.69%、0.26%、1.45%、0.17%（n＝6）。

2.5.10 含量測定 分別取12批茶芎樣品，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。采用Graph-Pad Prism 9.3.0軟件對數據進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，結果見表5。由表5可知，12批茶芎藥材中，阿魏酸含量均在0.4 mg/g以上，3個產地茶芎中該成分含量兩兩比較差異均有統計學意義，且以瑞昌茶芎最高（P＜0.05或P＜0.01），故可作為標志性成分；洋川芎內酯A含量均高于或接近于1.2 mg/g，3個產地茶芎中該成分含量兩兩比較差異均有統計學意義，且以瑞昌茶芎最高（P＜0.05或P＜0.01），故也可作為標志性成分；E-藁本內酯含量均在0.1 mg/g以上，兩兩比較差異顯著且德安茶芎顯著高于其他產地茶芎（P＜0.01），故也可作為標志性成分；瑞昌、武寧、德安茶芎中Z-藁本內酯的含量分別高于8.0、7.0、4.0 mg/g，兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.01），故也可作為標志性成分。上述含量測定結果也佐證了OPLS-DA模型的預測結果，阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯均可作為影響質量的差異性成分。

表5 12批茶芎樣品中4種成分的含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑及提取方式的選擇

在前期預實驗中，本課題組分別考察了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）對目標成分含量的影響，經單因素方差分析可知，70%甲醇對目標成分的提取效果最好，且與其他溶劑提取效果比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。同時，本課題組分別考察了不同提取方式（回流提取法、超聲提取法）對目標成分含量的影響，經單因素方差分析可知，兩種提取方式對目標成分含量的影響并不顯著（P＞0.05），故考慮到實驗操作的便捷性，本研究選擇了超聲提取法。

3.2 流動相及檢測波長的選擇

在色譜條件考察過程中，由于樣品含有有機酸類成分，為防止色譜峰拖尾，故使用0.1%磷酸溶液作為水相，并先后考察了乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液的洗脫效果。結果顯示，當以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，所得色譜圖基線較為平穩，各色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。通過二極管陣列紫外-可見光檢測器在190～800 nm內進行全波長掃描發現，當吸收波長為280 nm時，各色譜峰峰形和分離度均較好，參照峰（Z-藁本內酯）響應較強，故最終選擇檢測波長為280 nm。

3.3 指紋圖譜及多元統計分析

12批茶芎藥材共有17個共有峰。相似度評價結果顯示，12批茶芎藥材的相似度均高于0.980，說明3個產地茶芎藥材的化學成分種類差異較小，藥材質量相對穩定；根據CA和OPLS-DA結果可知，S1～S5（武寧茶芎）聚為一類，S6～S8（瑞昌茶芎）聚為一類，S9～S12（德安茶芎）聚為一類，提示藥材受產地環境的影響較為明顯。根據PCA綜合評價分析可知，S6～S8（瑞昌茶芎）的綜合評分較高，其次為武寧茶芎（S1～S5）和德安茶芎（S9～S12）。可見，CA、PCA、OPLS-DA可為不同產地茶芎藥材的質量評價和質量控制提供依據。

3.4 差異性成分的篩選及含量測定分析

中藥成分具有復雜性和多效性，采用單一指標成分難以實現對其質量的整體控制，故多種成分的同時測定是中藥質量控制的重要研究方向。本研究運用OPLS-DA篩選出4個差異性成分，即阿魏酸、洋川芎內酯A、E-藁本內酯、Z-藁本內酯。通過含量測定發現，3個產地茶芎樣品中4種成分兩兩比較，差異均有統計學意義，再次說明這4種成分可作為標志性成分用以區分不同產地的茶芎藥材，并可為該藥材的全面評價和質量控制提供參考。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜、多元統計分析、含量測定方法穩定、可行，可用于茶芎藥材評價和質量控制。阿魏酸、洋川芎內酯A、Z-藁本內酯、E-藁本內酯可能是影響不同產地茶芎藥材質量的差異性成分，且前3種成分含量均以瑞昌茶芎最高，E-藁本內酯含量以德安茶芎最高。