肉桂人參顆粒的含量測定、指紋圖譜建立及差異標志物篩選Δ

高歡，胡北，李想，陳瑩，許子華（中國人民解放軍北部戰區總醫院藥劑科，沈陽 110003）

肉桂人參顆粒為中國人民解放軍北部戰區總醫院的院內制劑，是在古籍經典名方桂枝人參湯的基礎上制得，主要由肉桂、炙甘草、人參、白術、干姜5味藥材組成。方中肉桂溫里散寒、通利血脈，為君藥，桂皮醛、肉桂酸為其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、解熱鎮痛、抗腫瘤和保護神經等作用[1-3]；炙甘草益氣和中[4]，合肉桂辛甘化陽以扶衛，為臣藥，甘草苷、甘草酸銨為其主要成分，具有抗炎等作用[5]；人參、白術益氣健脾[6-7]，助甘草大補元氣[8]；干姜辛熱，溫中散寒、守而不走[9]，同為佐藥；諸藥合用，共奏和解表里之功效，治太陽病因誤下而成協熱下利、表里不解者[10]。該藥臨床上可用于治療外寒直中、營衛凝滯、血脈流行不利之證，常用于感冒、流行性感冒及胃潰瘍、急慢性胃腸炎等屬中陽不足者[11-12]，療效確切且不良反應較少。目前該藥相關的質量標準尚未建立。由于中成藥成分復雜，單一成分難以全面地反映中成藥的整體質量，故質量標準需測定多個指標成分，且需綜合考慮藥物所含的活性成分、君藥臣藥的特征成分以及含量較高成分等。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法以肉桂人參顆粒中君藥肉桂（含桂皮醛、肉桂酸）和臣藥炙甘草（含甘草酸銨、甘草苷）中的主要成分為指標進行定量分析，建立其指紋圖譜并進行相似度評價，同時結合化學模式識別分析篩選影響肉桂人參顆粒質量的差異標志物，旨在為該藥的質量評價及后續上市提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-16型HPLC儀、AUW120D型十萬分之一電子分析天平、AEL-160型萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司），KQ3200型超聲波清洗機（杭州微米派科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

甘草苷對照品（批號111610-201908，純度93.1%）、肉桂酸對照品（批號110786-201604，純度98.8%）、桂皮醛對照品（批號110710-202022，純度99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸銨對照品（批號wkq21021808，純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

肉桂（批號11321004）、人參（批號39021005）、干姜（批號00320015）、炙甘草（批號05721001）、白術（批號07020042）5種藥材均于2021年2月11日購自河北仁心藥業有限公司。上述藥材經沈陽藥科大學中藥學院陸金財教授鑒定，分別為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥樹皮、五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer的根、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖（經蜂蜜烘制而得）、菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根莖。

10批（編號S1～S10）肉桂人參顆粒[批號分別為20210228、20210309、20210312、20210425、20210426、20210427、20210428、20210429、20210430、20210501，規格為每袋裝15 g（無糖型）]均為中國人民解放軍北部戰區總醫院自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～20 min，10%B→17%B；20～30 min，17%B→20%B；30～70 min，20%B→26%B；70～112 min，26%B→40%B；112～120 min，40%B→50%B；120～130 min，50%B→10%B；130～140 min，10%B）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為265 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL[6，13-14]。

2.2 甘草酸銨等4種成分的含量測定

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成上述4個成分質量濃度分別為0.852、1.224、1.132、3.036 mg/mL的單一對照品貯備液。取各單一對照品貯備液適量，加甲醇，制成上述4個成分質量濃度分別為898.85、550.80、28.30、167.00 μg/mL的混合對照品貯備液；取1 mL，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇定容，即得上述4個成分質量濃度分別為89.89、55.08、2.83、16.70μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取肉桂人參顆粒約2 g，研成細粉，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率25 kHz）處理30 min，放至室溫，再次稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按肉桂人參顆粒的處方和制備工藝分別制備缺肉桂、甘草的陰性顆粒樣品，再按“2.2.2”項下方法制得各陰性對照溶液。

2.2.4 系統適用性試驗 分別取上述混合對照品溶液、供試品（編號S1）溶液、陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，在供試品色譜與對照品色譜相同的保留時間處有吸收峰，分離度均大于1.5，理論板數均不低于5 000，陰性對照對測定無干擾。結果見圖1。

圖1 系統適用性試驗的HPLC圖

2.2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋，得系列質量濃度的工作溶液（甘草酸銨質量濃度分別為17.98、35.95、89.89、179.77、359.54 μg/mL，甘草苷質量濃度分別為 11.02、22.03、55.08、110.16、220.32 μg/mL，肉桂酸質量濃度分別為0.57、1.13、2.83、5.66、11.32 μg/mL，桂皮醛質量濃度分別為3.34、6.68、16.70、33.40、66.80 μg/mL）。取上述系列工作溶液和混合對照品貯備液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果見表1。

表1 甘草酸銨等4種成分的回歸方程與線性范圍

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD分別為0.10%、0.09%、0.10%、0.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD分別為0.78%、1.14%、0.62%、0.77%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取肉桂人參顆粒（編號S1）共6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛含量的RSD分別為1.21%、1.72%、1.92%、2.31%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知量的肉桂人參顆粒1 g（編號S1），分別精密加入各單一對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 甘草酸銨等4種成分的加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 取10批肉桂人參顆粒（編號S1～S10）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每樣品平行測定3次。結果見表3。

表3 甘草酸銨等4種成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

2.3 肉桂人參顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰（分離度好、峰面積大、保留時間適中），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD≤2.02%（n＝6），相對峰面積的RSD≤2.04%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD≤0.36%（n＝6），相對峰面積的RSD≤4.36%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD≤0.86%（n＝7），相對峰面積的RSD≤4.01%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的生成 取10批肉桂人參顆粒（編號S1～S10）樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將得到的圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以各成分色譜響應均較強的S1樣品為參照，采用中位數法，時間窗寬度為0.3 min，經多點校正后進行Mark峰匹配，生成肉桂人參顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對照圖譜（R）。結果顯示，10批肉桂人參顆粒共有16個共有峰。結果見圖2。

圖2 10批肉桂人參顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對照圖譜

2.3.5 共有峰的指認 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（見圖3）。通過與混合對照品比對，共指認了4個共有峰，分別為甘草苷（6號峰）、肉桂酸（10號峰）、桂皮醛（11號峰）、甘草酸銨（15號峰）。

圖3 混合對照品溶液與供試品溶液的HPLC圖

2.3.6 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批肉桂人參顆粒指紋圖譜的相似度進行評價。結果顯示，10批樣品的指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.95，表明不同批次樣品的成分種類穩定，所建指紋圖譜可以反映肉桂人參顆粒的整體特征。結果見表4。

表4 10批肉桂人參顆粒的相似度評價結果

2.4 聚類分析

以16個共有峰的峰面積為變量，以平方歐氏距離為度量標準，采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析。結果顯示，當類間距離為10時，10批樣品可聚為3類，其中S3為一類，S1～S2、S4～S5、S10為一類，S6～S9為一類，表明不同批次樣品中各成分含量存在差異。結果見圖4。

圖4 10批肉桂人參顆粒的聚類分析樹狀圖

2.5 主成分分析

以16個共有峰峰面積為原始數據進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據，采用SPSS 25.0軟件進行主成分分析。結果顯示，前3個主成分的特征值大于1，累計方差貢獻率為91.918%。結果見表5（表中僅展示前3個主成分的數據）。

表5 主成分的特征值及方差貢獻率

2.6 正交偏最小二乘法-判別分析

以16個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值可用來衡量各共有峰的表達模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，以輔助篩選質量差異標志物[15]。結果顯示，10批樣品數據均落在95%置信區間內，10批樣品可分為3類，其中S3為一類，S1～S2、S4～S5、S10為一類，S6～S9為一類，與聚類分析結果一致。以VIP值大于1為標準篩選影響樣品質量的差異標志物[15]，結果顯示，有4個共有峰的VIP值大于1，分別為11號峰（桂皮醛）、15號峰（甘草酸銨）、6號峰（甘草苷）、9號峰（成分未知）。結果見圖6、圖7。

圖6 正交偏最小二乘法-判別分析的得分散點圖

圖7 共有峰的VIP值

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

參考2020年版《中國藥典》（一部），甘草苷和甘草酸銨的檢測波長為237 nm、桂皮醛為290 nm[6]。基于此，本研究分別考察了不同檢測波長（210、254、265、280、290 nm）對各色譜峰峰面積和分離度的影響。結果顯示，當檢測波長為265 nm時，各色譜峰的峰面積和分離度均較好，故選擇檢測波長為265 nm。

3.2 提取條件的優化

本研究考察了供試品溶液的制備方法，采用不同體積分數甲醇（50%、60%、70%、80%、100%甲醇）來提取樣品，結果顯示，以60%甲醇為提取溶劑時，各色譜峰的峰形較好，含量較高，故選擇提取溶劑為60%甲醇。本研究還考察了不同超聲時間（15、30、45 min）的提取效果，結果顯示，各成分含量可隨超聲時間增加而逐漸升高，但超聲30 min與超聲45 min對各成分含量的影響較小，考慮到實驗效率，故選擇超聲提取時間為30 min。

3.3 含量測定結果分析

含量測定結果顯示，10批肉桂人參顆粒中甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛的含量分別為1.808 4～2.770 0、1.137 2～1.481 4、0.076 5～0.091 8、0.130 9～0.478 4 mg/g，表明不同批次樣品間各成分含量存在差異，以桂皮醛的差異較大，這可能與制備過程中的加熱導致桂皮醛揮發有關。相似度評價結果顯示，不同批次樣品的相似度均大于0.95，其中S2、S4、S6樣品的相似度相對較低，這可能與藥材在貯藏或生產過程中造成的含量差異有關[16]。

3.4 指標成分的選擇與化學模式識別分析

10批肉桂人參顆粒共有16個共有峰，共指認出了4個共有峰，分別為甘草苷（6號峰）、肉桂酸（10號峰）、桂皮醛（11號峰）、甘草酸銨（15號峰）。桂皮醛和甘草苷均為2020年版《中國藥典》（一部）單味藥項下規定的指標成分[6]。通過主成分分析發現，前3個主成分的特征值大于1，表明這3個成分能夠概括樣品中的絕大部分信息。聚類分析結果顯示，10批樣品可聚為3類，其中S3為一類，S1～S2、S4～S5、S10聚為一類，S6～S9聚為一類；正交偏最小二乘法-判別分析結果顯示，11號峰（桂皮醛）、15號峰（甘草酸銨）、6號峰（甘草苷）、9號峰的VIP值大于1，表明甘草酸銨、桂皮醛、甘草苷和9號峰代表的化學成分可能是影響肉桂人參顆粒質量的差異標志物。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜及含量測定方法準確度高、重復性好，可用于肉桂人參顆粒的質量評價；甘草酸銨、桂皮醛、甘草苷等成分可能是影響肉桂人參顆粒質量的差異標志物。