膠質瘤中TRP基因家族預后模型的開發(fā)和驗證

郭兆剛，欒 濤，鄧 超，岳 博，祖 靜，萬 研

膠質瘤是一種發(fā)病率最高的原發(fā)性腦腫瘤,根據(jù)WHO指南，可分為高級別膠質瘤(Ⅲ-Ⅳ)與低級別膠質瘤(Ⅰ-Ⅱ)。目前外科手術聯(lián)合放化療治療效果有限，患者中位生存期依然保持在15個月以下。尋找新的分型并預測患者預后對指導膠質瘤的臨床治療具有重大意義。瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道為位于細胞膜上的離子通道蛋白，通過形成四聚體結構行使非選擇性陽離子跨膜運輸功能。在哺乳動物中，有7個TRP亞家族，包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML和TRPN。除調(diào)節(jié)感覺及激素和信息素信號傳導的作用外，TRP基因家族也可通過影響細胞周期、細胞凋亡、氧化應激等促進腫瘤進展。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫和CGGA數(shù)據(jù)庫中的膠質瘤測序數(shù)據(jù)，探討有影響的TRP家族蛋白對膠質瘤預后的影響。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 使用Perl語言從UCSC Xena網(wǎng)站中下載的TCGA target GTEx數(shù)據(jù)集中提取膠質瘤(低級別膠質瘤523例、高級別膠質瘤171例)和正常腦皮質(105例)的基因表達數(shù)據(jù)及膠質瘤患者的臨床信息，并從CGGA數(shù)據(jù)庫中提取了1018例膠質瘤患者的基因表達數(shù)據(jù)及臨床信息。

1.2 預后模型的構建與驗證 在R語言中，使用TCGA中數(shù)據(jù)進行單因素COX回歸分析以確定與預后相關的TRP家族基因，使用“glmnet”包建立LASSO-COX回歸和多因素COX回歸模型，在此基礎上進行風險評分計算以評估患者預后，并使用CGGA數(shù)據(jù)進行預后模型的效能驗證。

1.3 臨床特征的預后分析 采用R語言對患者年齡、病理分級、性別、復發(fā)類型及風險得分進行單因素和多因素COX分析以探究其對膠質瘤預后是否有影響。

1.4 免疫浸潤分析 使用CIBERSORT以評估患者風險評分與免疫細胞浸潤之間的相關性。

1.5 統(tǒng)計學處理 TRP基因家族在膠質瘤組織及正常對照組織中的表達差異使用Wilcoxon檢驗；TRP基因家族表達情況及不同風險亞組與膠質瘤患者的預后相關性使用Kaplan-Meier方法分析及l(fā)og-rank檢驗進行比較；<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TRP家族在膠質瘤的表達及與預后的關系 與105組正常腦皮質樣本相比，在膠質瘤患者中，TRPC2、TRPC4、TRPC6、TRPC7、TRPM7、TRPM8、TRPV4表達顯著上調(diào)，TRPA1、TRPC5、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPV1、TRPV3、TRPV5顯著下調(diào)(圖1)；使用GEPIA網(wǎng)頁工具評估TRP基因家族與患者預后相關性(表1)，提示TRP基因家族在膠質瘤中表達失調(diào)且會影響膠質瘤患者的生存周期。

2.2 預后模型構建與效能驗證 為進一步理解TRP基因家族與膠質瘤患者預后的相關性，使用單因素COX回歸分析確定與膠質瘤預后相關的18個TRP基因(TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM2、TRPM4、TRPM6、TRPM7、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4、TRPV5、TRPV6)，進一步利用LASSO-COX回歸分析，從上述18個TRP基因家族中篩選出7個基因TRPC1、TRPC3、TRPM4、TRPM6、TRPM8、TRPV2、TRPV4以構建預后模型[風險得分= Exp×(-0.1067)+Exp×(-0.0286)+Exp×0.1614+Exp×(-0.1432)+Exp×0.2074+Exp×0.2022+Exp×0.0114)]。

根據(jù)得分中位值，將患者分為高危亞組(=341)和低危亞組(=342)，結果顯示，在高危組中TRPM8、TRPV4、TRPM4、TRPV2表達水平較高，在低危組中TRPM6、TRPC1、TRPC3表達水平較高。使用KM分析發(fā)現(xiàn)，高危組5年生存率(0.0586)顯著低于低危組(0.1491)，差異有統(tǒng)計學意義(<0.001)。為進一步評估TRP家族基因的預后模型對總生存期預測的累積效應，計算受試者操作特征曲線下面積，1、3、5年的AUC值均>0.8，提示該預后模型有優(yōu)秀的預測效能(圖2)。在CGGA數(shù)據(jù)庫中進一步驗證該預后模型，高危組五年生存率依然明顯低于低危組，差異有統(tǒng)計學意義(<0.001)；1、3、5年的AUC值均>0.6，提示該預后模型在CGGA驗證集中依然有較高的可信度(圖3)。

2.3 患者臨床特征的預后分析 為闡明膠質瘤患者的臨床特征與預后之間的關系，進行了單因素與多因素COX回歸分析。單因素COX回歸及多因素COX回歸分析結果顯示患者風險評分與患者的年齡和疾病病理分級均可作為獨立因素評價患者預后(圖4)。

2.4 高低風險組免疫浸潤分析 使用CIBERSORT免疫浸潤算法評估風險評分與患者免疫浸潤之間的相關性。發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞、M0巨噬細胞、M1巨噬細胞、靜止型肥大細胞、中性粒細胞、靜止型自然殺傷細胞、漿細胞、活化型記憶CD4T細胞、靜止型記憶CD4T細胞、調(diào)節(jié)型T細胞與風險評分呈正相關型，嗜酸性粒細胞、M2巨噬細胞、活化型肥大細胞、單核細胞、活化型自然殺傷細胞、CD4幼稚性T細胞、CD8T細胞、濾泡輔助性T細胞與風險評分呈負相關性，表明高風險患者中自然殺傷細胞的活性降低及記憶CD4T細胞的休眠導致其免疫系統(tǒng)抗腫瘤的活性相較低風險組較弱；而低風險組患者中CD4幼稚性T細胞、濾泡輔助性T細胞的增加使得患者免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性更高；提示免疫微環(huán)境中不同免疫細胞的組分差異是高低評分亞組生存率差異的原因之一(表2)。

3 討 論

TRP基因家族于1969年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。1997年，Caterina等首先報道了TRPV1可被辣椒素及加熱所激活，確認了TRP基因編碼的蛋白質在感覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。隨后，有學者對TRP家族基因所編碼的蛋白在溫度、拉伸/壓力、化學物質、氧化/還原、滲透壓和pH值等細胞周圍環(huán)境的感受作用進行了報道；研究發(fā)現(xiàn)，除作為細胞感受器作用外，TRP家族基因在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。使用SKF96365抑制TRPC亞家族可以導致膠質瘤細胞系D54MG發(fā)生G/M期阻滯并最終導致細胞死亡；TRPM2的表達上調(diào)導致氧化應激和細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而促進膠質瘤細胞系的凋亡；過表達TRPM8可以通過ERK通路依賴的方式增強膠質瘤細胞的侵襲性和增殖能力；在膠質母干細胞中，TRPV2的過表達會導致膠質纖維酸性蛋白及βⅢ型微管蛋白的表達上調(diào)，從而促進角質表型的分化，同時抑制膠質干細胞在體內(nèi)和體外的增殖。

隨著分子病理學進展，越來越多的分子標志物被應用于判斷膠質瘤患者的預后，但單個臨床因素或者單個基因特征易受多個因素的影響，對患者預后判斷的準確程度有待評估，膠質瘤患者需要更為嚴謹?shù)念A后模型以指導精準化醫(yī)療。本研究通過探索與膠質瘤進展相關的TRP基因家族，結果發(fā)現(xiàn)TRP基因家族在膠質瘤中存在廣泛異常表達，且與患者預后有關。使用TRP基因家族基于523例低級別膠質瘤和171例高級別膠質瘤樣本的表達數(shù)據(jù)構建的預后模型在訓練集(1、3、5年AUC均>0.08)和驗證集(1、3、5年AUC均>0.06)中均表現(xiàn)出了良好的預后效能。單因素及多因素回歸分析顯示，基于TRP家族基因的風險評分可以作為預測患者不良預后的獨立因素。此外，基于預后模型對膠質瘤患者進行高低風險分組，低風險組預后均明顯優(yōu)于高風險組。本研究免疫浸潤分析結果提示，低風險組中活化性自然殺傷細胞、CD4幼稚型T細胞、濾泡輔助性T細胞的比例均高于高風險組，低風險組患者對膠質瘤的免疫反應性更強。

綜上所述，TRP基因家族構建的預后模型具有預測膠質瘤患者預后的能力，且可以指導膠質瘤的臨床診療，但TRP基因家族在膠質瘤進展及影響免疫細胞浸潤的潛在分子機制仍需進一步實驗探究。