顱內動脈瘤大鼠不同組織中端粒長度與動脈瘤大小的相關性

裴美娟，于 迪，史新宇，于海波

顱內動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是顱內動脈血管壁因局限性病理性擴張而發生的瘤樣突起，是導致出血性腦卒中的重要疾病之一，總人口發病率為2%～5%，IA年破裂率為0.8%～2%，并與患病時間呈正相關。端粒是衰老領域近年來的研究熱點，端粒的重復序列TTAGGG帽結構能夠發揮保護染色體、維持遺傳系統穩定的作用。同時，端粒也會隨著細胞分裂而逐漸縮短，當其縮短達到臨界長度時，會導致細胞失去分裂增殖能力并衰老凋亡。研究發現，端粒長度變化在IA的發生發展中可能扮演重要作用，本實驗擬進一步探討在IA模型大鼠體內，不同組織中端粒長度變化是否一致，并與IA的大小進行相關性分析，以求尋找能夠更為準確預測IA形成的生物學標志物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性SD大鼠50只，6～7周齡，體重200～250 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，每日光照12 h，5只/籠，標準飲食適應性飼養1周。許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 主要儀器設備 手術顯微鏡及顯微手術器械(新天醫療有限公司)，NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國)，real-time PCR儀(Step One，美國)，掃描電子顯微鏡(萊卡公司，美國)。

1.3 主要試劑耗材 0.9%氯化鈉注射液、戊巴比妥鈉、肝素鈉、L-甲硫氨酸(北京索萊寶科技)，肝素抗凝管(積水醫療公司)，DNA提取試劑盒(北京天根生物科技)，real-time PCR試劑盒(UltraSYBR Mixture With ROXⅡ，北京康為世紀)，Batson's #17組織侵蝕試劑盒(東莞市漢諾生物技術)。

1.4 大鼠分組及模型的構建 SD大鼠隨機分為2組(=25)，IA組和對照組。腹腔內注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。 IA組操作：頸中線切口，分離頸總動脈和迷走神經，結扎右頸總動脈。背部縱向切口，切除卵巢。顯微鏡(10x)下分離雙側腎動脈后支并結扎。對照組：暴露右側頸總動脈和腎動脈雙側后支15 min，關閉傷口縫合皮膚。術后大鼠正常飲食。如出現不進食癥狀或死亡，進行相應補充。1周后，IA組喂食含有3%L-蛋氨酸和8%氯化鈉的飼料，對照組予正常飼料，兩組均予自由飲食。

1.5 標本采集 術后6個月，SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后采集標本。(1)血液：眼眶取血0.5 ml，肝素抗凝；(2)皮膚：剪取雙側耳緣皮膚3 mm×3 mm；(3)肌肉：取右側大腿部骨骼肌組織約1 g；(4)心肌、主動脈、脾臟、腎臟：完成血管鑄型后解剖取材。所有組織標本均在-80 ℃條件下儲存。

1.6 血管鑄型及掃描電子顯微鏡觀察

1.6.1 灌注液配置 將Batson’s #17組織侵蝕試劑盒中的Base Solution A 分兩等份(100 mL/份)，其中一份加25 ml催化劑Catalyst，另一份中加入24滴促進劑Promoter C。灌注前將兩份Base Solution A混合均勻，加2%紅色染料，30 min內完成灌注。

1.6.2 血管鑄型 頸椎離斷法處死SD大鼠，16號灌胃針從左心室插入升主動脈，剪開左心耳排空血液后將10 ml混合之后的單體樹脂灌注液緩慢注入，直至左心耳流出灌注液。灌注完成后，將大鼠整體置于通風櫥內1 h待樹脂凝固，取出大腦，僅保留顱底動脈及附著的腦組織，浸泡于質量濃度為50%氫氧化鈉溶液內3 d，每2 h搖晃一次，每2 d更換溶液一次，制得完整Willis環。掃描電子顯微鏡下觀察，記錄IA大小及分期。

1.7 熒光定量PCR 按照試劑盒說明書提取各組織及血液的基因組DNA。所有反應條件分兩步進行：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min共40個循環，然后0.3 ℃梯度升溫進行熔解曲線分析。 使用2方法計算每個基因的相對表達水平。端粒引物序列：上游-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAG GGT(終濃度100 nmol/L)，下游- TCCCGACTATCCCTATCCCTAT CCCTATCCCT ATCCCTA(終濃度900 nmol/L)。內參GAPDH引物序列：上游- TACACTGAGGA CCAGGTTG(終濃度400 nmol/L)，下游- CCCTGTTGCTGTAGCCATA(終濃度400 nmol/L)。

2 結 果

2.1 IA形成情況 通過顯微鏡觀察血管鑄型，IA組共有20只(18%)大鼠形成動脈瘤，其中3只(12%)形成Ⅰ期瘤體，9只(36%)形成Ⅱ期瘤體，3只(32%)形成Ⅲ期瘤體，5只(20%)形成為多發動脈瘤，共形成28處瘤體。其中Ⅱ期以上瘤體24個，Ⅱ期瘤體直徑為(94.46±42.00)μm，Ⅲ期瘤體直徑為(262.43±146.59)μm。

2.2 大鼠組織端粒長度變化 以對照組骨骼肌組織的端粒長度為標準，繪制各部位端粒長度變化。可見與對照組比較，IA組心肌組織和主動脈組織端粒長度增加，血液中細胞端粒長度顯著縮短，差異有統計學意義(<0.05)；脾組織、腎組織、骨骼肌組織以及皮膚組織中，兩組的端粒長度變化差異均無統計學意義(>0.05，表1)。

2.3 IA組大鼠組織間端粒長度相關性 IA組大鼠外周血與主動脈端粒長度呈負相關，差異有統計學意義(=-0.45，<0.05)；主動脈與脾臟端粒長度呈正相關(=0.47，<0.05)，差異均有統計學意義。IA組大鼠各組織間端粒長度的相關性比較可見，僅脾臟和肌組織端粒長度呈負相關(=-0.515，<0.05，圖1)。

2.4 IA組大鼠組織端粒長度與IA大小的相關性 各部位組織中的，僅心肌組織端粒長度與IA大小呈正相關(=0.585，=0.014，圖2)。主動脈及外周血液細胞與IA大小無顯著相關性(<0.05)。

3 討 論

端粒長度的調控主要是由端粒酶和端粒結合蛋白共同發揮作用而完成的。當受到外界損傷時，端粒長度可發生動態變化，并調控細胞的凋亡。既往有研究發現端粒在IA的發病中可能發揮重要作用，但腦血管組織端粒長度的測量在臨床中難以實現，且哺乳動物體內不同組織的端粒長度也不盡相同，端粒長度的變化與IA的大小是否存在相關性有待進一步探討。胚層是產生各種組織器官的物質基礎，其中血管組織就由中胚層發育而來，中胚層主要由動物極內卷細胞形成。皮膚中的真皮層、骨骼以及肌肉所構成的運動系統、循環系統(包括血液、淋巴器官、骨髓、心臟和血管)、生殖系統、排泄系統和內臟器官的外部結締組織等均由中胚層發育而來。故本實驗選取了心肌組織、主動脈組織、血液、脾組織、腎組織、骨骼肌組織及皮膚組織進行研究。

本研究發現，IA組血液中端粒長度顯著縮短，這可能是由于在高血壓、高同型半胱氨酸血癥、血流動力學改變、低雌激素水平等因素的綜合作用下，機體的氧化應激水平得到了顯著升高，這將帶來過量的氧自由基，過多的氧自由基可將端粒重復序列TTAGGG的5’-端的G堿基氧化成7,8-二氫-8氧鳥嘌呤，進而直接影響端粒酶與端粒的結合，使端粒酶活性下降，同時血液中細胞更新速度較快，使得損傷因素加速了有絲分裂中的細胞端粒長度的不斷縮短。實驗還發現IA組心肌細胞中端粒長度顯著延長，可能是由兩方面原因造成，一是炎癥和氧化應激激活了端粒修復系統。機體氧化應激水平雖可以部分抑制端粒酶的活性，但同時也可能激活了端粒-端粒酶系統的修復功能，在它的幫助下使端粒酶活性大幅代償性增高，進而掩蓋了抑制部分的作用。二是心肌細胞中，細胞有絲分裂程度較低。既往研究發現，哺乳動物的心肌細胞在正常情況下，出生后不久即會因為體內某些細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的活性增強，促細胞分裂周期因子下調，使得心肌細胞成為終末分化有絲分裂后細胞，失去有絲分裂能力。例如人類的心肌細胞則在出生后3到6個月后逐漸停止有絲分裂，并主要停滯于G0期，僅在心肌細胞損傷發生后，例如心力衰竭或心肌梗死患者體內，可見心肌分裂指數顯著提高。結果顯示，IA組大鼠的主動脈端粒長度顯著長于對照組，這與心肌端粒長度變化趨勢一致。可能原因除了上述的端粒損傷-修復系統失衡外，可能還與細胞自身功能有關。研究發現，細胞中存在一個維持細胞穩定和凋亡的最佳端粒長度，端粒過長可導致本該凋亡的基因缺陷細胞繼續存活，同樣會導致染色體的不穩定和遺傳異常。

各組織中端粒長度的相關性分析可見，在對照組中端粒長度呈顯著相關性的組織，卻在IA組中無顯著相關性，端粒長度在對照組中無顯著相關性的脾臟和骨骼肌組織，在IA組中卻呈負相關。這表明在不利因素的影響下，不同的組織中端粒長度的變化也各不相同。這與Kes?niemi等的研究結果類似，其發現暴露在切爾諾貝利核電站附近高環境背景輻射水平中可導致田鼠肝臟和睪丸中端粒長度的縮短，但是對腦組織、卵巢和心肌細胞中端粒長度的影響卻無統計學意義。這可能是由于端粒除了受端粒酶的影響外，其長度的穩態還受多種途徑調節，例如重組介導的端粒交替延長等，但其中具體機制尚不清楚。由此可見關于端粒長度在不同疾病及不同組織中變化的研究結果并不一致，這可能與端粒復雜的損傷-修復系統有關，具體機制仍有待于進一步探索。

端粒長度與IA大小相關性研究發現，血液和主動脈端粒長度變化雖然與IA的形成相關，但與IA的大小無關，提示外部不利環境對血液和主動脈端粒的影響程度與對IA的影響程度并不一致。研究表明，無合并癥的IA患病率約為3.2%，平均年齡為50歲，但每年動脈瘤性蛛網膜下腔出血的發病率約為6-16/10萬，絕大部分動脈瘤最終都不會破裂，特別是小動脈瘤。大部分動脈瘤在經過數年的發展，機體會通過在動脈壁形成大量的膠原增生，使血管壁的抗張強度得到顯著提升，從而促進IA的穩定。但外周血白細胞卻始終處于不斷地更新中，炎癥、氧化應激等不利因素在細胞的有絲分裂過程中會對端粒造成持續的影響，使端粒長度不斷縮短。主動脈中包含血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，雖然其也處于不斷的自我更新之中，在有絲分裂時會受到不利因素的影響，但其更新速度遠慢于血細胞，在端粒損傷-修復系統的作用下，不利因素的持續刺激也會使端粒酶、端粒結合蛋白等端粒修復因子代償性增高，使其受損的端粒得到一定修復，即端粒長度處于動態調節過程，雖最終呈現為端粒長度的延長，但并非線性的增加，故與IA的尺寸未能呈線性相關。而心肌細胞的端粒長度，與IA的大小呈正相關，這可能與心肌細胞自身特性有關。雖然損傷因素可對全身細胞造成影響，但是心肌細胞幾乎不進行有絲分裂，在端粒結合蛋白的保護下，損傷因素對端粒造成的影響很小，反而是端粒修復系統的激活可使端粒長度緩慢增加，從而出現了端粒延長的現象。

綜上所述，本實驗通過構建IA大鼠模型，檢測了若干不同組織中端粒長度的變化，及其與IA大小的相關性，發現端粒長度的變化存在組織特異性，且端粒在IA的發生及發展中扮演重要角色，但是具體機制仍有待于進一步探索。