PIGN表達(dá)水平對腦膠質(zhì)瘤治療的臨床意義

王嵐生，李歡，于如同

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。盡管已有無數(shù)治療措施與靶點(diǎn)用于治療其他癌癥，但GBM的治療仍然依靠手術(shù)為主，輔助以放療和替莫唑胺(temozolomide，TMZ)為主的化療。雖然腦膠質(zhì)瘤的治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是GBM患者的中位生存期僅14個月[2-3]，由于腫瘤的自我保護(hù)，快速增長及先天藥物抗性等特點(diǎn)，使腦膠質(zhì)瘤成為最具挑戰(zhàn)性的癌癥[4]，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療對其治療效果均不理想。此外GBM患者生存期超過兩年之后，復(fù)發(fā)率高達(dá)50%，患者的5年死亡率高達(dá)95%[5]，因此亟須一個有效的治療靶點(diǎn)來改善患者的預(yù)后。

癌癥染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability，CIN)導(dǎo)致染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變化的速率增加，并產(chǎn)生腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[6-7]。在大多數(shù)實(shí)體瘤中均觀察到CIN，其與不良預(yù)后和耐藥性相關(guān)[8-9]。《自然》雜志發(fā)現(xiàn)了編碼在18q染色體上新的CIN抑制基因PIGN(也稱為MCD4)，這個基因在CIN+結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)中經(jīng)常丟失拷貝數(shù)[10]。相對于CIN-CRC細(xì)胞，CIN+CRC細(xì)胞復(fù)制更易受損并且存在DNA復(fù)制錯誤增加的現(xiàn)象，PIGN基因沉默會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性染色體異常加劇了有絲分裂中染色體的錯聚。相關(guān)研究表明，當(dāng)PIGN發(fā)生突變時，PIGN表達(dá)異常，基因表達(dá)增加，但蛋白質(zhì)生成減少，產(chǎn)生與基因沉默相似的效果[11]。

在對白血病的研究中，對55例MDS患者的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行的隨機(jī)森林分析表明，GPI錨定生物合成基因表達(dá)與基因組不穩(wěn)定性之間存在顯著(P=0.000 7)相關(guān)性(Pearson r=-0.406 8)，其中參與GPI-AP生物合成的基因PIGN，在預(yù)測MDS進(jìn)展的風(fēng)險方面，被列為第三重要因素。此外，在白血病轉(zhuǎn)化與進(jìn)展過程中，PIGN基因表達(dá)異常與白血病細(xì)胞中GPI-AP缺乏的頻率增加有關(guān)。將健康的正常人作為對照組，這些患者中的大多數(shù)(約60%)具有顯著(P<0.000 1)的高表達(dá)PIGN基因。此外，在35例接受PIGN轉(zhuǎn)錄和翻譯檢查的患者樣本中，有15例存在異常表達(dá)模式(即轉(zhuǎn)錄活性增加，但減少至無蛋白質(zhì)產(chǎn)生)。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，一組高危MDS或AML-MRC患者出現(xiàn)PIGN表達(dá)異常，基因表達(dá)增加，但蛋白質(zhì)生成減少[11]。

總之，PIGN的異常表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤患者的意義鮮有研究。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，探究PIGN在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入693例腦膠質(zhì)瘤患者的信息，腫瘤相關(guān)基因信息及對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)均從CGGA中獲取[12-13](www.cgga.org.cn)。為明確PIGN基因的低表達(dá)與高表達(dá)，將這些患者按照PIGN表達(dá)水平的中位數(shù)(2.65)分為高、低表達(dá)組，高表達(dá)組346例患者，低表達(dá)組347例患者。為探討PIGN表達(dá)與后續(xù)治療的關(guān)系，將510例接受放療的患者按照PIGN中位表達(dá)水平(2.74)分為高、低表達(dá)組，每組各255例。同理，將486例接受化療患者按中位表達(dá)水平(2.61)分為高、低表達(dá)組，每組各243例。

1.2 生存分析 生存期是指自患者病理學(xué)確診之日起，至患者死亡或末次隨訪時間之間的時間。運(yùn)用Kaplan-Meier分析法分析低表達(dá)組患者和高表達(dá)組患者的生存期。

1.3 相關(guān)性分析 運(yùn)用生物信息學(xué)方法整理CGGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)，采用Pearson相關(guān)分析法篩選與PIGN表達(dá)相關(guān)的基因，篩選條件為相關(guān)系數(shù)>0.4，P<0.05。采用SPSS23進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 PIGN在不同腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況 通過整理CGGA數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)PIGN表達(dá)于各級別腦膠質(zhì)瘤中，該表達(dá)趨勢不受腦膠質(zhì)瘤級別的影響(P=0.77，圖1A)。在各腦膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)病理分型中，PIGN的表達(dá)趨勢也不受影響(P=0.51；圖1B)。根據(jù)2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，PIGN在星型細(xì)胞腫瘤(IDH野生型/突變型)、間變型星型細(xì)胞腫瘤(IDH野生型/突變型)、少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤(IDH野生型，1p19q聯(lián)合缺失)和膠質(zhì)母細(xì)胞腫瘤(IDH野生型/突變型)中均勻表達(dá)，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.48；圖1C)。

A：WHO分級各級別膠質(zhì)瘤中PIGN表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異； B：各腦膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)病理分型中，PIGN的表達(dá)趨勢也無統(tǒng)計學(xué)差異； C：中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，PIGN的表達(dá)趨勢也不受影響圖1 PIGN在各型膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2.2 PIGN表達(dá)水平與對腦膠質(zhì)瘤患者的生存期影響 從CGGA中得到693例mRNA序列樣本，患者PIGN的表達(dá)水平按其中位數(shù)(2.65)分為低表達(dá)水平(n=347)和高表達(dá)水平(n=346)，通過Kaplan-Meier生存分析得出，PIGN低表達(dá)組的腦膠質(zhì)瘤患者總生存期長于高表達(dá)組(P=0.003 7，圖2)。將這些患者全部的影響因素納入多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型分析，結(jié)果表明PIGN的表達(dá)水平、年齡、IDH突變及染色體1p19q的聯(lián)合缺失是評估腦膠質(zhì)瘤患者生存的獨(dú)立影響因素(HR分別為1.337，1.332，2.225，1.761；P值分別為0.003，0.008，<0.001，<0.001；表1)。綜上所述，PIGN低表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者其預(yù)后要明顯好于PIGN高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者，并且PIGN表達(dá)水平是腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

圖2 膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

表1 多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.3 PIGN表達(dá)水平對腦膠質(zhì)瘤放療與化療的影響本研究中，共510例患者接受了放射治療，按其PIGN的中位表達(dá)水平(2.74)分為低表達(dá)患者(n=255)和高表達(dá)患者(n=255)。通過Kaplan-Meier生存分析得出，PIGN低表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者在接受放療后，生存時間與PIGN高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.084 4，圖3A)。隨后本研究統(tǒng)計了486例接受TMZ為主的化療患者，按其PIGN的中位表達(dá)水平(2.61)分為低表達(dá)患者(n=243)和高表達(dá)患者(n=243)。通過Kaplan-Meier生存分析得出，PIGN低表達(dá)的患者在接受化療后生存時間長于PIGN高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者(P=0.034 9，圖3B)。

圖3 PIGN表達(dá)水平對腦膠質(zhì)瘤放療與化療的影響

2.4 PIGN表達(dá)與MAD1表達(dá)水平的相關(guān)性 采用Pearson相關(guān)分析法，以相關(guān)系數(shù)>0.4，P<0.05為篩選條件，對CGGA中693例患者基因表達(dá)信息進(jìn)行篩選。Pearson相關(guān)性分析得出，MAD1表達(dá)與PIGN表達(dá)成明顯負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.775，P<0.001(圖4)。

3 討 論

PIGN基因是一個編碼在18q染色體上的新的CIN抑制基因(也稱為MCD4)。PIGN基因表達(dá)異常可歸因于外顯子14和15之間的部分內(nèi)含子保留，導(dǎo)致移碼和提前終止，這與基因組不穩(wěn)定標(biāo)志物表達(dá)的升高有關(guān)。近年來研究表明，PIGN在MDS[11]和結(jié)直腸癌[10]中可作為治療靶點(diǎn)。目前PIGN在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)和具體功能尚未完全闡明。本研究首次通過CGGA數(shù)據(jù)庫對693例患者信息進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)PIGN廣泛表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤中，且不會隨著腦膠質(zhì)瘤的級別或病理分型而改變。2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類整合了表型和基因型特征進(jìn)行腫瘤分類，有助于增加診斷的準(zhǔn)確性，幫助改善患者的診療與管理。在新分類中，本研究發(fā)現(xiàn)PIGN的表達(dá)也不存在差異性。大量研究表明腦膠質(zhì)瘤的級別和病理分型對患者的預(yù)后影響極大，而本研究發(fā)現(xiàn)無論是傳統(tǒng)病理分型，還是納入分子病理特征的最新版的WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分型，PIGN表達(dá)都與分子和病理無關(guān)。基于此，本研究推測PIGN有可能是一個獨(dú)立于其他已知因素的新的影響因子。

關(guān)于PIGN對腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后影響尚無文獻(xiàn)報道。運(yùn)用CGGA數(shù)據(jù)庫中693例腦膠質(zhì)瘤患者信息，通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，PIGN低表達(dá)患者的預(yù)后好于高表達(dá)患者。而且本研究通過Cox風(fēng)險比例回歸模型進(jìn)一步證實(shí)PIGN是影響膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立影響因子。根據(jù)以上結(jié)果，本研究推測PIGN具有促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用，抑制PIGN的表達(dá)可以改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

為了進(jìn)一步探究PIGN與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展之間的機(jī)制，本研究通過Pearson相關(guān)分析觀察到，細(xì)胞周期依賴性的PIGN表達(dá)與紡錘體裝配檢查點(diǎn)(SAC)蛋白MAD1的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。MAD1是有絲分裂檢查點(diǎn)的關(guān)鍵組成部分，該蛋白可以推遲有絲分裂后期開始直到所有染色體正確附著到紡錘體上。線粒體結(jié)合的MAD1充當(dāng)催化劑，幫助蛋白MAD2與有絲分裂調(diào)節(jié)劑Cdc20結(jié)合，從而產(chǎn)生有絲分裂后期抑制劑[14]。在人類細(xì)胞中，MAD1蛋白通過與Tpr結(jié)合而穩(wěn)定，有助于促進(jìn)MAD1和MAD2的線粒體募集[15]。總之，MAD1的正常表達(dá)保證了有絲分裂完整性，在維持染色體穩(wěn)定性和預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)化/進(jìn)展中至關(guān)重要。PIGN和MAD1在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)最少， SAC主要負(fù)責(zé)確保中期到后期過渡過程中染色體的正確分離[16]。即使在源自健康個體的CD34+單核細(xì)胞中，PIGN抑制/敲除也會引起MAD1抑制，同時，MAD1抑制導(dǎo)致PIGN的表達(dá)降低。這些發(fā)現(xiàn)揭示了SAC組件MAD1和PIGN之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。同時PIGN的基因表達(dá)又有其特殊點(diǎn)，當(dāng)PIGN發(fā)生突變時，PIGN表達(dá)異常，基因表達(dá)增加，但蛋白質(zhì)生成減少[11]。基于本研究的結(jié)果設(shè)想，由于PIGN表達(dá)和MAD1表達(dá)具有顯著的負(fù)相關(guān)性，PIGN基因發(fā)生突變時，基因異常高表達(dá)，蛋白產(chǎn)生減少，MAD1表達(dá)就變低，進(jìn)而出現(xiàn)有絲分裂的不受抑制，有絲分裂的穩(wěn)定性下降，進(jìn)而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。但本研究具有局限性，PIGN低表達(dá)改善腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的機(jī)制尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗研究來證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在接受TMZ為主化療的患者中，PIGN表達(dá)水平低的患者的生存期優(yōu)于高表達(dá)患者，而在接受放療的患者中，PIGN的表達(dá)不能預(yù)示患者的生存期。基于這一結(jié)果，本研究推測PIGN低表達(dá)組患者化療敏感性優(yōu)于PIGN高表達(dá)組患者，抑制PIGN表達(dá)可能會改善腦膠質(zhì)瘤的化療耐藥性，增強(qiáng)臨床腦膠質(zhì)瘤患者的化療敏感性。化療是臨床治療腦膠質(zhì)瘤的重要手段之一，耐化學(xué)性仍然是GBM治療中最嚴(yán)重的障礙。TMZ是目前用于GBM的一線化療藥物，是一種DNA烷基化抗腫瘤藥，可在細(xì)胞復(fù)制過程中誘導(dǎo)DNA鏈斷裂并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-18]。盡管在過去30年中GBM的治療取得了顯著進(jìn)步，但中位生存期并未得到明顯改善。凋亡抗性是腫瘤細(xì)胞的重要特征。線粒體凋亡由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)，該蛋白控制線粒體中細(xì)胞色素(Cyt-C)的釋放。已知BAD介導(dǎo)內(nèi)源性線粒體依賴性細(xì)胞凋亡[19-20]，它們將增加外膜的通透性并觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放，并隨后級聯(lián)激活Caspase家族，從而導(dǎo)致關(guān)鍵下游蛋白的激活和相應(yīng)的基因組DNA損傷[21]。最近的研究表明，TMZ治療可能通過BAD22改變線粒體凋亡的途徑。盡管如此，BAD監(jiān)管的具體機(jī)制仍待探索。簡而言之，BAD的表達(dá)量越高，癌細(xì)胞的化療抵抗越低，化療的療效越好；反之，當(dāng)BAD低表達(dá)時，癌細(xì)胞的化療抵抗增強(qiáng)。為了驗證這個想法，本研究對比了BAD與MAD1的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.587，P<0.001(圖5)。基于本研究成果設(shè)想，PIGN的異常高表達(dá)有可能通過負(fù)調(diào)節(jié)MAD1的表達(dá)，參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞BAD的低表達(dá)，在化療的凋亡抵抗中起重要作用。

圖5 BAD表達(dá)與MAD1表達(dá)的關(guān)系

總之，PIGN的表達(dá)水平是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，其可能成為一個新的有效的治療靶點(diǎn)。而且PIGN表達(dá)水平可以影響化療患者的預(yù)后，因而PIGN抑制劑可能成為臨床上的化療增敏劑，從而改善膠質(zhì)瘤患者的生存周期。但本研究患者數(shù)據(jù)量有限，其具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步實(shí)驗研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。