麻黃升麻湯對急性肺損傷大鼠微生物多樣性和碳水化合物酶譜的影響*

劉明燃，宋博，王琳，孟祥龍，劉必旺，高麗，彭濤，馬艷苗

(1.山西中醫藥大學基礎醫學院，晉中 030619；2.河南中醫藥大學第二附屬醫院，鄭州 450046；3.山西省中西醫結合醫院，太原 030013)

腸缺血-再灌注損傷會導致黏膜損傷、屏障破壞和急性炎癥反應，常繼發于腸道和腸系膜血管疾病[1]。其可引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，引發炎癥、活性氧生成、血管通透性增加、促炎細胞因子釋放、炎癥細胞浸潤及肺纖維化[2]。

人類和動物的消化道是由數萬億微生物細胞組成的多樣化生態系統。哺乳動物的內在(由宿主基因組編碼)消化能力極度不足，而微生物的關鍵作用之一是幫助宿主消化大量復雜碳水化合物。近年來基于DNA的宏基因組技術的出現，為人類深入探究微生物群DNA 分類學和功能譜提供了技術支持，并將微生物群與健康、疾病聯系起來[3]。

人類與復雜的微生物組合共同進化，其中人類腸道微生物群(human gut microbiota，HGM) 是新陳代謝和全身健康的關鍵驅動因素。HGM組成的異常變化與嚴重的代謝、炎癥、腫瘤疾病有關。聚糖代謝是塑造腸道微生物群動態和進化的關鍵因素[4]，木聚糖結構差異也可以影響腸道微生物的組成和生長[5]。

中藥復方中大多含有較多的糖類成分，多糖越復雜，其分解所需要的酶就越多。人類基因組最多只編碼17種酶來消化食物聚糖，特別是淀粉、蔗糖和乳糖。高度復雜和可變的植物細胞壁多糖，如木聚糖、木葡聚糖和果膠的分解需要大量不同的糖苷酶的協同作用。中藥含有多種多糖，具有多重生物活性，能夠調節免疫、抗病毒、抗炎和抗氧化，激活菌群與免疫系統間的信號通路，刺激免疫細胞，進而調節機體免疫。例如麻黃中ESP-B4多糖可以改善H1N1病毒所致的ALI，并能顯著增加小鼠腸道菌群中有益菌的豐度，發揮治療作用[6]。腸道微生物不僅能降解中藥多糖釋放有機酸、氣體和短鏈脂肪酸等發酵產物，同時也能降解動物源性多聚糖及腸上皮分泌的內源性黏蛋白[7]。腸道微生物還可彌補人體自身編碼糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GHs)和糖基轉移酶(glycosyl transferases，GTs)的不足[8]，增加人參皂苷等中藥多糖類活性成分的生物利用度[9]。

ALI屬于中醫“喘脫”“結胸”“暴喘”等范疇。前期研究發現，經方麻黃升麻湯能夠降低ALI 動物模型肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中可溶性晚期糖基化終末產物受體、白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，抑制 Ager-RAGE、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)p65 的轉錄活性[10]。由于腸缺血-再灌注引起ALI是一種全身繼發性疾病，從腸道穩態失衡入手探究其發病機制可能加深對急性肺損傷的理解。

本研究借助宏基因組測序，分析腸缺血-再灌注對ALI大鼠腸道微生物多樣性及碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)的特點及差異，將從“藥物微生物組學”角度為中藥復方治療ALI提供深入的數據支持與參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠，5周齡，購自維通利華(北京)實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2017-0005。 飼養環境：溫度(23±2) ℃，濕度(50±10)%，24 h晝夜節律光照。適應性喂養 1 周后開始實驗。

1.1.2藥物與試劑 麻黃升麻湯(由麻黃 、升麻 、當歸、知母 、黃芩、玉竹、白芍、天冬、桂枝、茯苓、甘草、石膏、白術、干姜組成)藥材購自晉中市同仁堂藥房連鎖有限公司，藥材經山西省中醫藥研究院吉海杰副主任藥師鑒定為正品。飲片用純化水浸泡30 min，煎煮2 次后合并濾液，濃縮4 ℃備用。醋酸地塞米松購自天藥藥業(天津)股份有限公司(批號：20200416)。

1.1.3儀器 倒置熒光顯微鏡(NIKON公司，型號Ti2-U)，M220TM聚焦超聲儀(Covaris Inc.，Woburn，MA，USA)，Illumina基因組分析儀(HiseqPE150，Illumina公司)，CLC基因組工作臺(v7.0.3，CLC bio)，宏基因組圖譜統計分析(stampv.2.1.3)軟件。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 將32只大鼠用完全隨機設計分為假手術組、模型對照組、地塞米松組(5 mg·kg-1)、麻黃升麻湯組(17 g·kg-1)，每組8只。造模前，假手術組、模型對照組給予純化水，地塞米松組、麻黃升麻湯組給予相應藥物，灌胃，連續給藥3 d。腹腔注射10%水合氯醛0.2×10-2mL·g-1，仰臥位固定，消毒后腹部切口入腹，腸管向右撥向體外，0.9%氯化鈉溶液浸潤的紗布濕潤暴露腸管，暴露并游離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，以無創動脈夾夾閉SMA造成小腸完全缺血后將小腸還納回腹腔，閉合腹部手術切口。持續缺血1 h后，去除無創動脈夾，恢復血供2 h，結束實驗。假手術組僅游離SMA不做夾閉。

1.2.2糞便樣本取材 治療結束后，每組隨機選取大鼠5只，結腸無菌采集糞便2～4粒，迅速置于滅菌凍存管，-80 ℃保存。

1.2.3一般情況 動物處死后沿氣管完整取下全肺，結扎右肺上葉后用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗肺部，收集BALF 1 mL，鋪在6孔板中，30 min后，待肺泡巨噬細胞完全貼壁后，隨機選取5個視野在倒置顯微鏡下計數[11]。

1.2.4肺組織病理組織學觀察 冰上取左肺后，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察肺組織病理形態的變化。

1.2.5大鼠糞便總DNA提取與宏基因組建庫 利用糞便基因組DNA 提取試劑盒提取糞便樣品中微生物基因組DNA。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。將純化后的DNA隨機打斷成小片段長度為350 bp，質量達到建庫要求的樣本采用Illumina Hiseq平臺測序。

1.2.6宏基因組測序 ①數據評估及質控。對測序的原始數據通過FastQC軟件進行質量評估，去除Illumina平臺的Fastq序列中的接頭，并根據堿基質量值對Fastq進行修剪。Raw Reads通過堿基識別的分析手段將原始圖像數據轉化為FASTQ文件格式存儲。使用FastQC評估樣本測序數據的質量，通過Trimmomatic軟件的2種過濾模式，分別對應SE和PE測序數據，過濾處理原始數據得到Clean數據。

②拼接組裝、預測及基因集構建。使用IDBA_UD進行組裝拼接成長序列，根據reads間的overlap關系，獲得contigs，經多次調整參數后獲得最優組裝結果，選擇最佳組裝結果。采用Prodigal對拼接結果進行ORF預測，選擇長度≥100 bp的基因，并將其翻譯成氨基酸序列。采用CD-HIT軟件進行去冗余，獲得非冗余的基因集。

③生物信息學分析。該步驟以bowtie2工具進行比對，將基因集和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、CAZy等數據庫進行比對，獲得基因的物種注釋信息和功能注釋信息、功能和物種豐度。

基于以上結果進行物種與功能組成分析、物種與功能差異分析、樣本比較分析等，對結果做可視化展示，挖掘數據中的有效信息，揭露隱含的規律，驗證實驗假設和發現新的問題。數據分析由生工生物工程(上海)有限公司完成。

2 結果

2.1大鼠肺巨噬細胞浸潤及肺組織、結腸組織病理變化 通過麻黃升麻湯對ALI過度應答反應的干預發現，麻黃升麻湯能夠降低ALI致炎后肺泡巨噬細胞的浸潤數量(P<0.05)(圖1)。

A.假手術組；B.模型對照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。①與模型對照組比較，t=-11.452～4.514，P<0.05。圖1 4組大鼠肺巨噬細胞浸潤情況 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.①Compared with model control group，t=-11.452—4.514，P< 0.05.Fig.1 Pulmonary macrophage infiltration in four groups of rats

對大鼠肺、結腸遠端組織進行HE染色發現，假手術組大鼠細支氣管、肺泡及小動脈結構正常，肺泡間質內輕度充血；模型對照組可見細支氣管及肺泡擴張充血，肺泡間炎癥細胞浸潤；麻黃升麻湯組肺泡間質內輕度充血，細支氣管、肺泡及小動脈未見異常；地塞米松組肺泡間見少許淋巴細胞浸潤(圖2)。結腸遠端組織病理結果顯示，假手術組黏膜及黏膜以下肌層未見特殊；模型對照組黏膜皺襞擴張，間質疏松水腫，炎癥細胞浸潤；麻黃升麻湯組黏膜未見著變，肌層及漿膜結構正常；地塞米松組黏膜糜爛，黏膜下疏松水腫，少許炎癥細胞浸潤(圖2)。

2.2物種分布——微生物群落結構分析

2.2.1門(Phylum)水平分布 給藥治療后，各組大鼠的腸道優勢菌門構成及相對豐度見圖3。腸道菌群優勢菌門以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)為主。其中模型對照組擬桿菌門較其余3組豐度顯著降低(P<0.01)，放線菌門相較于假手術組和麻黃升麻湯組豐度升高(P<0.05)，地塞米松組擬桿菌門相對豐度最高，為64%，高于其他3組(P<0.01)。 擬桿菌門是人或動物腸道內的常在菌，主要作用于類固醇、膽汁酸及多糖的代謝，也可以幫助宿主對多糖的吸收及蛋白質的合成，但有時也會成為病原菌[12]。假手術組、模型對照組和麻黃升麻湯組擬桿菌門相對豐度分別為45%，47%，57%。變形菌門是細菌門中最龐大的一門，包括很多致病性細菌，如大腸埃希菌、幽門螺桿菌、沙門菌、霍亂弧菌等。地塞米松組變形菌門相對豐度最高，占比為 6%，與地塞米松組比較，其余3組均降低，其中 麻黃升麻湯組最低，為1%。

A.假手術組；B.模型對照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。圖2 4組大鼠肺組織和腸組織病理形態學改變(×100) A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.Fig.2 Pathomorphological changes of lung and intestine in four groups of rats(×100)

2.2.2屬(Genus)水平分布 各組大鼠腸道菌群優勢菌屬構成及相對豐度見圖 3。正常菌群優勢菌屬包括：擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等；與假手術組比較，模型對照組擬桿菌屬、普雷沃菌屬(Prevotella)和乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度均有所下降(P<0.05)；假手術組乳桿菌屬相對豐度為 11%，模型對照組、地塞米松組、麻黃升麻湯組分別為 5%，7%，6%，表明麻黃升麻湯能在一定程度上提升大鼠腸道乳桿菌比例。

A.假手術組；B.模型對照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。圖3 大鼠腸道優勢菌在門和屬水平的構成及相對豐度 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.Fig.3 Composition and relative abundance of dominant bacteria in rat gut at phylum and genus levels

2.2.3α多樣性指數分析 與假手術組比較，模型對照組香農指數降低，辛普森指數升高(P<0.05)；與模型對照組比較，其余3組香農指數均顯著升高，辛普森指數均顯著降低(P<0.01)(圖4)；上述結果提示，模型對照組大鼠腸道菌群豐富度和多樣性明顯降低，麻黃升麻湯能恢復大鼠腸道菌群豐富度和多樣性。

A.假手術組；B.模型對照組；C.麻黃升麻湯組；D.地塞米松組。①與模型對照組比較，t=-15.542～6.482，P<0.05。圖4 4組大鼠α多樣性指數比較 A.sham group；B.model control group；C.Mahuang Shengma decoction group；D.dexamethasone group.①Compared with model control group，t=-15.542—6.482，P< 0.05.Fig.4 Comparison of α diversity index among four groups of rats

2.2.4Beta多樣性分析 Beta多樣性分析常用PCoA(principal co-ordinates analysis)觀察個體或群體間的差異。結果見圖5。模型對照組樣品點與其他各組樣品點距離較遠，表明細菌群落組成存在明顯差異，顯示進行造模干預后可以影響正常大鼠腸道菌群的結構及多樣性。各治療組坐標點與假手術組樣品點距離接近，且明顯偏離于模型對照組，提示藥物組群落組成與假手術組更相似。說明麻黃升麻湯、地塞米松均可以調節感染后大鼠腸道菌群組成結構。

圖5 4組大鼠不同維度菌群多樣性分布的PCoA圖 Fig.5 PCoA diagram of flora diversity distribution from different dimensions in four groups of rats

2.2.5組間差異物種的篩選 采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)篩選組間顯著差異菌種。LDA 值(2～4)可得出兩組間顯著差異菌。 顯著差異菌在假手術組、模型對照組、麻黃升麻湯組中豐度對比，見圖6。由差異菌在種和屬豐度對比發現，麻黃升麻湯組的g_Prevotella、g_Bacteroides、g_Lactobacillus、g_Ruminococcus較模型對照組升高；模型對照組s_Lactobacillus_reuteri較假手術組有所升高。

圖6 3組大鼠差異菌的種和屬豐度比較 Fig.6 Comparison of species and genus abundance of differential bacteria among three groups of rats

2.2.6KEGG功能注釋 KEGG通路中共展示6個板塊的一級信號通路注釋信息，由圖7可知，顯示新陳代謝通路的注釋水平較高，二級代謝通路中碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)表達最為顯著。進一步注釋碳水化合物三級通路，富集表達較為顯著為蔗糖和淀粉代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、糖酵解/糖異生(glycolysis gluconeo-genesis)等是麻黃升麻湯干預ALI的主要代謝途徑。

圖7 KEGG 通路和碳水化合物通路三級注釋結果 Fig.7 Result of KEGG Pathway and three-level annotation of carbohydrate pathway

2.2.7碳水化合物活性酶注釋 CAZy數據庫約有300種酶，其主要包含 GHs、 GTs、多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PLs)等。基因集蛋白序列與CAZy數據庫比對后，可得到對應的碳水化合物活性酶注釋信息。篩選條件為E-value<1e-5。并統計CAZy各功能層級的豐度。GH、GT和糖類酯解酶(carbohydrate esterase，CE)在各組中豐度較為富集，各組在GH和GT酶類家族顯著富集的豐度對比見圖8。

3 討論

腸缺血-再灌注不僅會損傷腸道，還會嚴重損傷遠端器官，特別是引起肺損傷。缺血-再灌注誘導ALI的一個顯著特征是過度炎癥反應，釋放促炎癥細胞因子、巨噬細胞浸潤和細菌源性內毒素[13]。然而，缺血-再灌注誘導ALI的機制尚未闡明。本研究對缺血-再灌注腸道內容物進行了宏基因組測序，研究了腸道微生物組成和CAZy注釋，為研究中藥復方的大分子碳水化合物提供參考。

麻黃升麻湯方證的主要表現為咽喉不利、唾膿血、泄利不止、手足厥寒、發熱，脈沉遲，有肺閉之危，氣脫之象，臨床常用于治療間質性肺病、肺纖維化等復雜疾病[14]。通過對麻黃升麻湯組腸道微生物組成分析發現，厚壁菌門和擬桿菌門為其優勢菌門。厚壁菌門可以降解和發酵碳水化合物產生丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽等短鏈脂肪酸，可調節抗炎調節性T細胞(Treg)數量和功能以及上皮完整性[15]，從而降低炎癥性疾病的風險[16]。擬桿菌門能夠降解蛋白質、碳水化合物和脂肪，氨基酸可被腸道細菌用于產生短鏈脂肪酸 和支鏈氨基酸[17]。大部分(> 90%)碳水化合物降解酶主要來源于隸屬于厚壁菌門和擬桿菌門的微生物[18]。

本研究結果顯示，麻黃升麻湯干預后屬水平的厚壁菌屬(Firmicutes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃菌屬(Prevotella)及乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度較高。擬桿菌是腸道微生物群中的優勢屬，腸道中碳水化合物的主要來源淀粉、多糖是擬桿菌的易發酵底物[19]。乳桿菌屬(Lactobacillus)能夠利用可發酵碳水化合物產生乳酸，降低胃腸道pH值，防止致病菌的入侵和定植[20]，普雷沃菌可以合成丁酸鹽，調節宿主的代謝和免疫反應，改善上皮細胞的完整性和屏障功能，從而預防炎癥[21]，這可能是麻黃升麻湯抑制腸缺血-再灌注過度炎癥反應引起的肺內巨噬細胞浸潤趨化、肺毛細血管損傷，保護遠端靶器官的作用機制。

①與模型對照組比較，t=-10.251～3.128，P<0.05。圖8 各組大鼠碳水化合物活性酶豐度比較 ①Compared with model control group，t=-10.251—3.128，P< 0.05.Fig.8 Comparison of abundance of carbohydrate active enzymes in each group

KEGG功能注釋中，碳水化合物三級注釋發現蔗糖和淀粉代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解/糖異生是麻黃升麻湯干預ALI的主要代謝途徑，這些途徑通常與碳水化合物降解的短鏈脂肪酸有關，是影響腸道微生物群組成和平衡的重要決定因素。

腸道中的碳水化合物組成對塑造腸道微生物群多樣性具有深遠的影響，并通過防止病原體定植和提供次生代謝物來維持人類健康。這種環境刺激了編碼CAZy 的復雜微生物基因庫的進化，因為只有短的聚糖基底才能穿透細菌的細胞壁。人類擬桿菌屬通過離散的多糖利用位點[22]切割聚糖中的大多數糖苷鍵，來獲取和降解最復雜的聚糖[23]，產生SCFAs，從而被腸道內皮吸收[24]。

從腸道微生物CAZy注釋的結果來看，各組在GHs、GTs類家族呈現顯著富集的豐度對比，麻黃升麻湯組的GH2、GH13、GH43、GT4的表達顯著高于急性肺損傷組，提示麻黃升麻湯中的碳水化合物活性酶利用率較高，這可能是其促進腸道菌群轉化吸收抗炎類小分子物質，發揮抗氧化、調節免疫平衡的基礎。

GHs用于水解碳水化合物底物(如植物細胞壁、淀粉顆粒和粘蛋白)的糖苷鍵。GH13 是主要的 α-淀粉酶家族，可水解淀粉相關碳水化合物的內部 α-1，4-糖苷鍵，是GHs 中最大的家族，執行淀粉或其他碳水化合物的降解，在葡萄糖循環中具有關鍵作用。GH43家族存在于許多植物細胞壁降解的微生物中，GHs通過清除機制切割復雜的碳水化合物，誘導自噬、DNA修復和抗氧化酶的表達[25]，維持機體穩態。GH2和GH3家族的酶則參與植物細胞壁的解構[26]。GTs家族與雙糖、寡糖及多糖的合成有關，負責催化糖苷鍵斷裂，在人體微生物的適應性和致病性方面起著重要作用。

植物乳桿菌和擬桿菌屬編碼大量 β-半乳糖苷酶[27]，瘤胃菌能夠作用于碳水化合物降解酶系統和轉運蛋白的組織[28]，厚壁菌門中的梭狀芽孢桿菌屬可能是復合碳水化合物的主要降解物。普雷沃菌能夠產生針對植物基多糖和木聚糖降解的CAZy，包括GH3家族的xylan-1、4-β-木糖苷酶、GH43的β-木糖苷酶和GH13家族的淀粉水解酶。經過酶促作用后存在的大量未消化的淀粉能夠被屬于GH13家族的微生物酶降解。擬桿菌門編碼來自許多家族的GHs和PLs，能靶向包含目標聚糖的所有或大部分連接[29]，本研究結果與之一致。

相同藥物在不同個體中表現出顯著不同的療效和毒性，影響患者的治療效果。不同α/β葡萄糖苷酶活性和微生物生物轉化潛力的個體特異性腸道微生物群，與人類的個體差異密切相關，并與中醫的“體質”學說不謀而合，也就是說微生物可能通過生物轉化或調節宿主酶影響藥物代謝。而腸道微生物群在微生物組成和代謝功能方面的可塑性將成為提高藥物療效和安全性的潛在目標。在腸生態系統中，益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌已進化產生多種糖基水解酶，包括β-葡萄糖苷酶，有助于人參皂苷釋放苷元[30]。研究表明，人參多糖和大建中湯[31]可以塑造腸道微生物群結構并增強療效[32]。

系統生物學能夠揭示疾病中多組分和多靶點之間的潛在的復雜關聯，將為研究經方麻黃升麻湯提供更廣闊的平臺和新穎的視角。CAZy可能代表了人類腸道微生物群功能多樣性的一個有用的生物標志物，有助于指導治療腸缺血-再灌注等黏膜屏障障礙引發的繼發感染性疾病策略，通過靶向腸道微生物群的代謝功能可能會優化傳統藥物及復方的整體功效。