中華倒刺鲃TRPV1基因的克隆及對高溫和LPS刺激的響應

劉耀輝 謝云龍 張子恒 楊馨悅 盧敏芳 蒲德永 王志堅 張耀光 劉小紅

(1. 西南大學生命科學學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715; 2. 西南大學地理科學學院,重慶金佛山喀斯特生態系統國家野外科學觀測研究站, 重慶 400715)

瞬時受體電位香草酸亞型1 (Transient receptor potential vanilloid-1, TRPV1)屬于瞬時受體電位離子通道蛋白(TRP)超家族, 是哺乳類動物重要的溫度感受與調控蛋白[1,2]。作為最早被發現且研究最為深入的成員[3],TRPV1基因的相關研究仍主要見于哺乳動物。小鼠(Mus musculus)TRPV1基因參與了疼痛、體溫和滲透調節等多種生理活動和疾病的發生[4]。一方面,TRPV1參與了哺乳動物體溫及與體溫變化有關行為的調節, 如辣椒素處理可導致大鼠(Rattus norvegicus)體溫降低, 而這種效應可被TRPV1受體拮抗劑辣椒平(Capsazepine, CPZ)阻斷[5];阻斷TRPV1基因的表達會引起小鼠的體溫升高,TRPV1基因敲除小鼠對熱刺激的反應也明顯降低甚至缺失[6]。另一方面, 除辣椒素外, TRPV1蛋白的激活還受多種物理和化學因素的調控, 包括高溫、內源性炎癥介質和酸性環境[1]等, 如環境溫度高于43℃可激活小鼠TRPV1基因[7], 大鼠炎癥發熱時TRPV1蛋白被激活[8]等。炎癥多由外界病原生物感染而引起, 恒溫動物炎癥的發生常伴隨著身體或局部體溫的升高。因此, 炎癥因子具有引起體溫調控系統及相關信號通路改變的潛能, 研究者們也更傾向于認為TRPV1蛋白具有感應外界有害高溫和參與調節體內炎癥介導的體溫升高的作用。

在變溫動物中有關TRPV1的研究較少, 但現有的報道表明兩棲類和爬行類的TRPV1蛋白也具有感應熱溫的作用[9—11]; 而魚類TRPV1是否具有溫度感受功能則具有物種差異性。斑馬魚(Danio rerio)和大馬哈魚(Oncorhynchus keta)等TRPV1基因的表達具有熱溫敏感性, 但南極魚類如獨角雪冰魚(Chionodraco hamatus)和伯氏肩孔南極魚(Trematomus bernacchii)的TRPV1不具有感應溫度的能力[12]。

魚類是種類數量最多的脊椎動物, 水體溫度變化對魚類的生長、免疫和繁殖等生理活動甚至存活都具有決定性調控作用。中華倒刺鲃(Spinibar-bus sinensis)為長江上游珍稀特有魚類, 最適生長溫度為20—28℃, 其臨界低溫和臨界高溫分別為8.4℃和39.83℃[13]; 該魚具有肉質鮮美, 營養價值高和經濟效用強等特點, 為長江上游的優良養殖魚種, 開發利用價值高[14—16]。本研究以常規分子生物學技術, 開展了中華倒刺鲃TRPV1基因克隆、組織表達譜和生物信息學分析, 并檢測該基因在改變溫度和注射免疫刺激物后間腦和延腦的表達, 探討TRPV1在中華倒刺鲃體溫調節中的功能, 可為相關后續研究提供一定的理論鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用1齡中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)購買于重慶合川養殖場, 魚體長75—105 mm, 體重8.0—23.0 g。在充氧運回后, 養殖于淡水魚類資源與生長發育淡水魚類資源實驗室養殖大棚。實驗前, 于200 L水桶中, (25±0.5)℃水溫下人工馴養7d, 馴養期間充氧, 按照1.5%的體重比例在每天8:00和18:00投喂商業化餌料(山東升索飼料有限公司), 投喂1h后, 清理糞便并換1/4曝氣水。實驗前3天停止投喂。在實驗中, 水體溫度利用精密自動控溫加熱棒控制。

1.2 TRPV1基因克隆及序列分析

選取健康中華倒刺鲃1年齡幼魚6尾, 100 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222, Sigma-Aldrich, USA)麻醉致死后, 于冰上快速解剖并取腦的各部分組織, 經液氮速凍后–80℃保存備用。

根據已獲得的中華倒刺鲃轉錄組和NCBI有關數據, 設計用于擴增中華倒刺鲃TRPV1的引物(表 1)。購買RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, China)試劑, 根據說明書操作步驟提取中華倒刺鲃腦組織的總RNA。1%瓊脂糖電泳檢測后, 取1 μg總RNA為模板, 根據使用說明, 使用M-MLV試劑盒(TaKaRa, Dalian,China)逆轉錄為cDNA。產物稀釋5倍后, 取1 μL為模板, 加入終濃度為0.5 μmol/L的引物、0.1 U/μL的rTaq酶(TaKaRa, Dalian, China)、100 μmol/L的dNTPs (TaKaRa, Dalian, China), 混合后于Veriti PCR儀(Applied Biosystem, USA)進行PCR擴增。擴增反應程序為94℃預變性5min; 94℃ 30s; 55℃ 30s;72℃ 1.5min循環35次; 72℃延伸10min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根, 北京)切膠回收, 產物經電泳檢測后連接至 pMD19-T載體(TaKaRa, Dalian,China), 轉化DH5α大腸桿菌(天根, 北京), 經后續氨芐青霉素篩選和擴大培養, 取陽性克隆的菌液PCR產物進行測序驗證。

表1 中華倒刺鲃TRPV1基因克隆和表達分析所用引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression analysis of TRPV1 in Spinibarbus sinensis

測序所得序列經過NCBI網站初步比對分析后,使用DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)軟件包拼接、編輯并翻譯為氨基酸序列, 利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析中華倒刺鲃TRPV1蛋白的理化性質。下載各物種TRPV1蛋白序列, 使用MEGA5.1中的鄰接法構建系統發育樹,步展值設置為500。使用在線軟件如SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)進行蛋白質結構預測。

1.3 TRPV1基因的組織表達譜分析

取6尾健康1年齡中華倒刺鲃, 在上述馴養條件馴養7d后, 經MS222深度麻醉致死后, 冰上快速解剖并取間腦、延腦、中腦、小腦、端腦、鰓、皮膚、肝、腎、脾、腸、心臟和肌肉等組織, 液氮速凍后保存于–80℃備用。

根據說明書, 利用RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, China)分別提取上述組織總RNA, 各取1 μg RNA為模板, 使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China)逆轉錄為cDNA, 稀釋5倍后保存備用。

設計TRPV1和ACTB、GAPDH基因的特異性引物(表 1), 按照TB Green?Premix ExTaq? II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, Dalian, China)的使用說明,于20 μL反應體系中加入模板cDNA 1 μL和引物各0.5 μmol/L, 于Step one plus熒光定量PCR系統(Applied Biosystem, USA)進行熒光定量PCR 擴增(RT-qPCR)。反應程序為: 95℃預變性10min; 95℃ 15s;60℃ 30s循環40次; PCR擴增結束后, 以儀器自帶的參數進行溶解曲線反應。在RT-qPCR結束后, 以看家基因ACTB和GAPDH為內參[17], 計算中華倒刺鲃TRPV1基因的相對表達量。

1.4 溫度及LPS處理對TRPV1基因表達的影響

中華倒刺鲃的最適生長溫度為30℃以下, 高溫臨界溫度可高達39.8℃[13], 因此35℃是一個可以引起中華倒刺鲃產生應激反應但卻不致死的溫度。為檢測高溫是否可引起中華倒刺鲃TRPV1基因表達的改變, 設置無菌磷酸緩沖液(PBS)對照組和脂多糖(LPS)免疫刺激實驗組, 每組又分為25℃和35℃亞組。選取健康實驗魚, 室內25℃水溫下人工馴養7d, MS222麻醉后, 快速腹腔注射200 μL PBS或LPS (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, USA), 清潔水體中恢復1min后, 迅速轉移至不同水溫(25℃和35℃)的水桶內, 并分別在實驗處理后1h、6h和24h解剖實驗魚(N=6), 分離間腦和延腦等組織, 液氮速凍后–80℃保存待用。

按照1.2所述步驟提取各實驗魚間腦和延腦組織總RNA、逆轉錄, 進行RT-qPCR擴增, 并計算TRPV1基因在溫度和LPS處理后的實驗魚間腦和延腦組織的相對表達量。利用GraphPad Prism (California, USA)軟件的ANOVA進行數據統計分析,Fisher LSD方法進行多重比較, 并以P<0.05為標準判斷差異顯著。

2 結果

2.1 TRPV1基因序列克隆與分析

克隆得到的中華倒刺鲃TPRV1基因序列長2023 bp(GenBank登錄號: ON571553), 屬于該基因的CDS區域內序列, 可編碼含673個氨基酸殘基的多肽。通過比對分析, 該序列與歐洲鯉相似性最高,為88.80%, 與鯉科其他魚類相似性均在80%以上,而與非鯉科魚類的相似性<70%; 與非魚類脊椎動物的相似性<55%。克隆得到的中華倒刺鲃TRPV1序列所預測的多肽含有173個高度保守氨基酸位點,某些連續保守位點形成一個保守區段, 保守性相對低的序列主要位于N端、C端和中間的某些部位。系統發育樹顯示: 中華倒刺鲃與金線鲃、鯽、南亞野鯪、斑馬魚等鯉科魚類聚為一支, 并與大海鰱、大西洋鮭、斗魚、箭魚、南極冰魚等海水性魚類聚為的支形成姐妹群(圖 1)。

圖1 基于TRPV1氨基酸序列構建的系統發育樹(鄰接法, 步展值為500)Fig. 1 Phylogenetic tree of TRPV1 based on amino acids(Neighbor-joining method, with bootstrap value of 500)

2.2 TRPV1的蛋白結構預測與分析

克隆得到的中華倒刺鲃TRPV1序列編碼的多肽含有78個堿性氨基酸, 69個酸性氨基酸, 分別占該肽鏈氨基酸總數的11.59%和10.25%; 還有255個疏水性氨基酸和176個極性氨基酸, 分別占37.89%和26.15%。該肽鏈的理論等電點為8.75, 脂肪指數為96.92, 平均親水性為–0.087。

SMART和TMHMM預測分析表明, 中華倒刺鲃的TPRV1蛋白含有5個錨蛋白結構域(ANK)和6次跨膜α螺旋結構域, 同時跨膜結構域內形成離子轉運通道(Ion_trans)。SWISS-MODEL預測顯示,中華倒刺鲃TRPV1蛋白的高級結構可能由同源四聚體構成(圖 2)。

圖2 中華倒刺鲃TRPV1蛋白二級(A)和三級(B)結構預測Fig. 2 Protein secondary (A) and tertiary (B) structure prediction of Spinibarbus denticulatus TRPV1

2.3 中倒刺鲃TRPV1組織表達譜及其在高溫和LPS刺激后的表達變化

中華倒刺鲃TRPV1基因具有較為廣泛的組織表達, 在延腦及內臟如腎、脾和腸等有較高量表達,而在肌肉、皮膚、心臟和端腦表達量較低, 其他所檢測的組織如間腦和小腦則為中量表達(圖 3)。

圖3 中華倒刺鲃TRPV1基因的組織表達譜(N=6)Fig. 3 Tissue expression profile of TRPV1 in Spinibarbus denticulatus (N=6)

為判斷TRPV1的表達是否具有溫度和體內炎癥敏感性, 利用RT-qPCR檢測了該基因分別在注射了PBS和LPS, 并于不同水溫(25℃和35℃)中處理1h、6h和24h后中華倒刺鲃間腦和延腦表達量的變化(圖 4)。結果顯示在間腦, 35℃處理組實驗魚TRPV1表達量顯著低于25℃處理組; 當水體溫度為25℃時, 注射后6h的TRPV1基因表達量雖然相比較于注射后1h有顯著升高(P<0.0001), 但LPS組與PBS組無顯著差異; 注射后24h, LPS組實驗魚間腦中TRPV1基因的表達量顯著高于PBS組(P<0.01);當水體溫度為35℃時, 注射LPS或PBS 1h和24h均未檢測到TRPV1基因的顯著變化(圖 4A)。延腦的結果與間腦相反。在水體溫度為25℃時, 注射LPS與否對TRPV1基因的表達無顯著影響; 當水體溫度為35℃時, 注射6h后,TRPV1基因在LPS組中華倒刺鲃延腦的表達顯著高于PBS組, 而注射后24h, LPS組的表達量顯著低于PBS組(P<0.01; 圖 4B)。

圖4 溫度及LPS處理后在中華倒刺鲃TRPV1基因在間腦(A)和延腦(B)的表達Fig. 4 Relative expression levels of TRPV1 in the diencephalon (A) and medulla oblongata (B) of Spinibarbus denticulatus after temperature and LPS treatment (N=6; **P<0.01; ****P<0.0001)

3 討論

3.1 TRPV1蛋白的結構分析

TRPV1蛋白是公認的哺乳類動物的熱溫感應受體, 蛙類、爬行類和鳥類的TRPV1也被證實具有熱溫敏感性[9—11,18]。抑制爬行類動物如鱷(Crocodylus porosus)、蜥蜴(Amphibolurus muricatus)及恒溫動物鵪鶉(Coturnix chinensis)、斑胸草雀(Poephila guttata)的TRPV1可顯著改變他們在不同溫度環境中的行為以及身體溫度模式[11]。除了感應熱溫外,鳥類和哺乳類的TRPV1也具有感應體內炎癥的能力[4—18]。研究表明, 跨膜結構域是TRPV1感應各種外界刺激, 包括辣椒素、低pH、二價陽離子和高溫[19]的功能結構域; 而錨蛋白重復結構域具有動態控制TRPV1溫度敏感性的功能[20], 因此這兩種結構域對于TRPV1作為溫度感受器都至關重要。斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等魚TRPV1蛋白的結構域預測結果與哺乳類相似, 它們的TRPV1蛋白也能感應熱溫, 并能調節熱溫誘導的行為[21,22]。中華倒刺鲃TRPV1蛋白預測結構與也哺乳類TRPV1相似, 均含有離子轉運通道、6次跨膜α螺旋結構和錨蛋白重復結構域, 功能蛋白的組成上也與哺乳類TRPV1一致, 均為同源四聚體[23,24]。獨角雪冰魚(Chionodraco hamatus)和伯氏肩孔南極魚(Trematomus bernacchii)的TRPV1不能感應外界溫度變化[11], 其跨膜結構域無預測的離子轉運通道[12]。氨基酸組成差異是離子通道蛋白功能的種間差異的基礎。有研究表明, 僅一個氨基酸的改變都會導致如瞬時受體電位錨蛋白1(TRPA1)等離子通道蛋白巨大的種間溫度敏感差異[25], 獨角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的TRPV1溫度感應功能的缺失也被認為可能與其離子轉運通道的缺失有關[12]。因此根據預測結果, 中華倒刺鲃TRPV1蛋白應該具有溫度敏感性。

3.2 TRPV1基因的組織表達譜分析

TRPV1蛋白是一種可高效介導Ca2+流的非選擇性陽離子通道受體, 廣泛表達于哺乳類下丘腦和外周神經組織, 感覺神經元是其表達的主要場所,然而在哺乳類腦的其他區域, 表達量卻有限[26,27]。雖然如此, 哺乳類的TRPV1仍被認為同時具有能感知外界溫度和調節體內溫度的功能。爬行類灣鱷(Crocodylus porosus)的TRPV1基因的表達能在肌肉、心臟和肝臟中檢測到, 也因此其蛋白被認為同時具有感應身體外部溫度和作為體內溫度計的作用[11]。哺乳類的中樞體溫調控系統為視前核區域(Preoptic area, POA)-背內側下丘腦(Dorsal medial hypothalamus, DMH), 當感染或炎癥發生時, POADMH被激活并發出提高代謝率、促進產熱和減少皮膚組織熱量散失等生理和行為的指令, 進而引起體溫升高的發熱現象[28]。雖然魚類的視前核、腦干和脊髓都參與了體溫調節, 但溫度調控中樞仍然被認為是下丘腦的視前核腦區[29]。相較于哺乳類,魚類TRPV1基因具有更為廣泛的組織表達譜, 如虹鱒的TRPV1在內臟如腸道和腎臟高量表達量, 在腦的各部分區域如間腦、小腦、端腦、視頂蓋、松果體、垂體和視網膜等, 以及皮膚、血細胞和心臟等均有表達[30]; 鮭(Salmo salar)的TRPV1在端腦和視葉也有表達, 且其表達量還與病毒誘導的致炎因子升高相關[22]; 南亞野鯪(Labeo rohita)的TRPV1在精子中有表達, 并參與調節精子的溫度敏感性生理活動[31]。中華倒刺鲃TRPV1的表達與虹鱒相似, 也具有廣泛的組織表達譜, 表現為在內臟的表達量較高, 并在腦的各部分也有表達, 但在間腦的表達量小于延腦。與哺乳類TRPV1神經元發育較晚不同,斑馬魚的TRPV1神經元起源于第一波體感神經元發育, 對于魚類早期胚胎的存活具有重要調節作用[21]。這提示魚類TRPV1基因具有功能多樣性和復雜性。

3.3 魚類TRPV1蛋白的功能分析

體內和體外的實驗均已表明斑馬魚TRPV1蛋白具有感應高于25℃的溫度, 并參與調節熱溫誘導的行為[21,22]。在病毒感染后, 鮭TRPV1在視前核區域(Pre-Optic Area, POA)的表達與致炎基因(IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2)的表達及血清中致炎因子的含量顯著相關[22]。在本研究中, 高溫并沒有致使中華倒刺鲃TRPV1在間腦這一溫度調控中心的表達量升高; 對于25℃和35℃組的同一取材時間點, 高溫組實驗魚間腦TRPV1的表達量反而低于低溫組, 但在延腦的表達變化情況正好相反, 這說明水溫的變化可影響中華倒刺鲃TRPV1的表達, 但不同組織的TRPV1響應機制不同。腹腔注射可引起魚類的應激反應, 表現為在處理24h后, 實驗魚血清的Cortisol含量升高[32]。在25℃組, 不論注射PBS還是LPS的6h和24h后, 中華倒刺鲃間腦TRPV1都顯著升高, 但35℃組無變化; 同時在延腦,TRPV1的顯著表達變化發生在35℃組的注射后6h和24h。這說明注射這一行為導致的魚類應激反應也與TRPV1的表達有關, 但具體的變化模式具有組織和溫度特異性。LPS為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分, 是重要的特異性抗原, 能引起魚類的炎癥發生。在注射24h后的間腦和注射后6h的延腦, LPS組比PBS組實驗魚具有更高的TRPV1表達量, 提示中華倒刺鲃TRPV1基因的表達受到炎癥信號通路調控。值得注意的是, 間腦作為公認的溫度調控中心,TRPV1的表達變化模式與在延腦相反, 這也說明魚類TRPV1的功能具有組織差異性, 且魚類溫度調控機制也具有高度復雜性。