氧糖剝奪不同時(shí)間再灌注后對(duì)PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

施誠(chéng)龍，高永軍，王 振，陳景策，陳 沖，徐 蔚

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650101)

缺血性卒中(Ischemic Stroke，IS)是世界范圍內(nèi)最重要的死亡和殘疾原因之一[1]。在IS中，氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足會(huì)在幾小時(shí)內(nèi)造成腦損傷，然而，腦卒中后缺血/再灌注引起的神經(jīng)元損傷是一個(gè)多因素共同作用的過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)是最主要的機(jī)制之一[2]。在IS后24 h內(nèi)，循環(huán)中的白細(xì)胞能夠穿透受損的腦實(shí)質(zhì)，釋放補(bǔ)體因子和炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1)和TNF-a[3]。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(Pheochromocytoma cells，PC12 cells)細(xì)胞是體外卒中模型中最常用的神經(jīng)細(xì)胞系之一[4]，本研究采用體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞制作氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型來(lái)模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，觀察不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞的形態(tài)改變以及細(xì)胞炎癥因子IRAK1和TNF-a在mRNA水平上的表達(dá)，以探討OGD/R對(duì)PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、試劑、儀器

PC12細(xì)胞購(gòu)自于中科院昆明細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)為KCB200736YJ。主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒；mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)使用SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit試劑盒和BlazeTaqTMSYBR? Green qPCR Mix 2.0試劑盒；相關(guān)引物由生物公司合成。主要儀器：倒置顯微鏡、酶標(biāo)板自動(dòng)讀數(shù)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件下培養(yǎng)，24 h換液，培養(yǎng)2～4 d傳代。

1.2.2 OGD/R模型建立及分組

根據(jù)OGD的時(shí)間不同將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為5組(每組均進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn))：Normal組、OGD 3 h組、OGD 6 h組、OGD 12 h組和OGD 24 h組。建立OGD/R模型：將原培養(yǎng)基換成無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于94% N2、5% CO2和1% O2條件下模擬PC12細(xì)胞OGD損傷，OGD不同時(shí)間培養(yǎng)之后換用完全培養(yǎng)基置于37 ℃、95%濕度、5% CO2恒溫箱中復(fù)糖復(fù)氧繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下觀察OGD不同時(shí)間再?gòu)?fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)后PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及處理送檢。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按上述干預(yù)后每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃、95%濕度、5% CO2的恒溫箱中繼續(xù)孵育2 h并用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.4 QRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

OGD/R處理后，收集細(xì)胞用Trizol法提取RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本中RNA濃度及純度后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，PCR引物序列，見(jiàn)表1。采集記錄熒光，制作擴(kuò)增曲線和溶解曲線，讀取Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

未進(jìn)行OGD/R處理的PC12細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，細(xì)胞間相互連接交織成網(wǎng)狀，密度高，細(xì)胞體飽滿舒展，折光性好，從胞體發(fā)出長(zhǎng)短不一且有分枝的突起。進(jìn)行OGD/R處理的細(xì)胞，隨著OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞損傷逐漸明顯且細(xì)胞密度逐漸降低，間隙增大，樹(shù)突和軸突回縮，細(xì)胞皺縮變圓，體積變小，OGD 3 h后復(fù)糖復(fù)氧主要表現(xiàn)為細(xì)胞樹(shù)突和軸突部分回縮，細(xì)胞固縮，OGD 6 h后復(fù)糖復(fù)氧細(xì)胞樹(shù)突和軸突回縮較OGD 3 h明顯且固縮更為嚴(yán)重，細(xì)胞部分漂浮，OGD 12 h和OGD 24 h后復(fù)糖復(fù)氧與前2組比較出現(xiàn)更為明顯且范圍更廣的樹(shù)突和軸突回縮及細(xì)胞固縮等結(jié)構(gòu)破壞，有大量細(xì)胞碎片出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

2.2 不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞活性的改變

與Normal組相比OGD/R組細(xì)胞活力逐漸降低(P<0.05)，Normal組和OGD 3 h組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；OGD 6 h組、OGD 12 h組、OGD 24 h組與Normal組相比存活率明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 CCK-8試劑盒檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞活力

圖2 CCK-8試劑盒檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞活力

2.3 不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

與Normal組相比，OGD/R組細(xì)胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達(dá)升高，從OGD 6 h組開(kāi)始IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達(dá)具有差異(P<0.05)，在OGD 12 h組達(dá)到高峰，在OGD 24 h組出現(xiàn)回落，見(jiàn)表3、圖3。

表3 QRT-PCR檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達(dá)

圖3 QRT-PCR檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后PC12細(xì)胞IRAK1和TNF-a在mRNA水平的表達(dá)

3 討論

IS是最多見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦血管病之一，然而，影響IS病理生理和康復(fù)的決定因素還知之甚少，先前的研究已經(jīng)確定了幾種與IS有關(guān)的機(jī)制，其中，誘導(dǎo)缺血后炎癥的先天免疫反應(yīng)在IS進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[5]。作為先天免疫的重要參與環(huán)節(jié)，促炎細(xì)胞因子IRAK1和TNF-a被認(rèn)為在卒中的病理生理過(guò)程中扮演著尤為重要的角色[6，7]。髓系分化因子88招募IRAK4進(jìn)而磷酸化IRAK1，最終導(dǎo)致下游的核因子-κB的激活和TNF-a的釋放[8，9]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了IRAK1和TNF-a是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。在體外PC12細(xì)胞OGD/R模型中，OGD的時(shí)間是關(guān)鍵，OGD時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能誘導(dǎo)過(guò)度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，OGD時(shí)間過(guò)短則可能無(wú)法有效地誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此，對(duì)于OGD/R后PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究很有必要，其中OGD的時(shí)間窗是關(guān)鍵的研究要點(diǎn)，也是后續(xù)研究PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制及IS后神經(jīng)元保護(hù)的基礎(chǔ)。

在本研究中，我們通過(guò)構(gòu)建體外PC12細(xì)胞OGD/R模型以觀察PC12細(xì)胞不同時(shí)間OGD/R后細(xì)胞形態(tài)學(xué)及炎癥因子表達(dá)的變化，探討神經(jīng)元OGD不同時(shí)間后對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，倒置顯微鏡下觀察未進(jìn)行OGD/R處理的PC12細(xì)胞生長(zhǎng)良好形態(tài)正常，進(jìn)行OGD/R處理的細(xì)胞，隨著OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞損傷逐漸加重，主要表現(xiàn)為細(xì)胞樹(shù)突和軸突回縮，細(xì)胞固縮死亡。相關(guān)研究報(bào)道，在缺血性腦損傷中，缺血后小鼠腦內(nèi)蛋白的破壞程度及其對(duì)缺血結(jié)局的影響隨其缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[10，11]，與本研究結(jié)果一致。本研究中，OGD 3 h細(xì)胞損傷沒(méi)有明顯變化，可能原因是OGD 3 h對(duì)PC12細(xì)胞是一個(gè)短暫的亞致死性階段，因而再灌注不會(huì)導(dǎo)致太大的損傷。OGD 12 h后細(xì)胞損傷嚴(yán)重甚至大量死亡，說(shuō)明合適的OGD時(shí)間至關(guān)重要。與Normal組相比OGD各組細(xì)胞活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。相關(guān)研究報(bào)道，在OGD致PC12細(xì)胞損傷的體外模型中OGD導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著下降[12]，與本研究結(jié)果一致。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OGD組細(xì)胞中IRAK1和TNF-a的表達(dá)量明顯增加，表明不同時(shí)長(zhǎng)OGD/R后均可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在OGD 6 h組開(kāi)始有顯著性差異，在OGD 12 h組達(dá)到高峰。相關(guān)研究報(bào)道，在體外建立PC12細(xì)胞OGD/R模型中缺氧缺血性腦病組炎癥因子IRAK1和TNF-α表達(dá)均高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果一致[12]。隨著OGD時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生進(jìn)而氧化細(xì)胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致膜損傷，隨后通過(guò)壞死或凋亡模式導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，故炎癥因子的分泌反而減少，在OGD 24 h組出現(xiàn)回落。

綜上所述，OGD 6 h后再?gòu)?fù)糖復(fù)氧能較好地在體外誘導(dǎo)PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)且對(duì)細(xì)胞損傷較小，故推薦在體外OGD模型研究中OGD的時(shí)長(zhǎng)采用6 h為宜。這對(duì)于后續(xù)神經(jīng)炎癥相關(guān)干預(yù)措施的選擇研究及對(duì)缺血性卒中神經(jīng)元保護(hù)的研究具有重要指導(dǎo)價(jià)值。