TFPI-2在膀胱癌組織中的表達及臨床意義

劉錦裕，謝錦來，謝建兵

(福建省莆田學院附屬醫院 泌尿外科，福建 莆田 351100)

膀胱癌是我國泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，男性發病率位于全身惡性腫瘤第7位[1]。據統計2002年世界男性膀胱癌標準化死亡率約4/10萬，女性約1.3/10萬，男性約為女性的3～4倍[2]。膀胱癌已嚴重威脅人類的健康。組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)是一種 Kunitz 型蛋白酶抑制劑，在人類心、肝、腎等正常組織中廣泛表達[3]。研究發現TFPI-2可降低多種腫瘤的侵襲轉移能力，如乳腺癌[4]、肺癌[5]、甲狀腺癌[6]、膠質母細胞瘤[7]等。至于TFPI-2是否可降低膀胱癌的侵襲轉移能力有待進一步研究。本研究旨在探討TFPI-2與膀胱癌發生、發展的關系，并探討其可能機制，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2011年7月-2014年7月在莆田學院附屬醫院泌尿外科確診為膀胱癌并進行手術的患者共60例，男性45例，女性15例，年齡38～75歲，中位年齡(55.3±6.5)歲。其中非肌層浸潤性膀胱癌39例，浸潤性膀胱癌21例，標本均取癌組織及癌旁正常組織各1份(術后病理證實)。所取標本均放在-80 °C冰箱保存備用。

1.2 主要試劑

EliVision plus試劑盒、TFPI-2、血管內皮生長因子單克隆抗體(Vascular endothelical growth factor monodonal antibody，VEGF MCAb)、Real time PCR Master Mix(SYBR Green)、引物合成由某公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化

取非肌層浸潤性膀胱癌組織、浸潤性膀胱癌組織和癌旁正常組織進行常規石蠟切片(連續切片3張)，免疫組化按福州EliVision plus免疫組化試劑盒說明書進行。結果判定標準詳見參考文獻[8]。

1.3.2 Realtime PCR

用Trizol法提取非肌層浸潤性膀胱癌組織、浸潤性膀胱癌和癌旁正常組織總RNA，總cDNA的合成和PCR擴增參照試劑盒說明書進行。引物：TFPI-2上游引物CAGGAGCCAACAGACTACGG，下游引物AAATTGTTGGCGTTGCCCTC；VEGF上游引物CTGTCTAATGCCCTGGAGCC，下游引物ACGCGAGTCTGTGTTTTTGC；GAPDH上游引物AGATCATCAGCAATGCCTCCT，下游引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。擴增產物長度：TFPI-2：119 bp；VEGF：124 bp；GAPDH：90 bp。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性15 s；60℃退火20 s(TFPI-2、VFGF、GAPDH)，72℃延伸40s；擴增35個循環。樣品和內參均設3個重復組。結果分析：從儀器中讀出TFPI-2、VEGF及GAPDH在以上3組中的循環閾值(cycle threshold，ct值)，ΔΔct=實驗組Δct-對照組△ct，組織含量大小主要是根據2-ΔΔct大小判定，2-ΔΔct值越大，組織含TFPI-2 mRNA、VEGF mRNA含量越高。2-ΔΔct值>1為目的基因表達上調；<1為目的基因表達下調。

1.3.3 統計學方法

2 結果

2.1 TFPI-2蛋白在癌旁正常組織、非肌層浸潤性膀胱癌組織、浸潤性膀胱癌組織中的表達情況

免疫組化顯示TFPI-2主要表達部位在細胞質，呈棕黃色。在癌旁正常組織中TFPI-2高表達，在膀胱癌組中呈低表達或不表達。60例癌旁正常組織中，TFPI-2 蛋白表達陽性者48例，陽性率達80%。60例膀胱癌組織中，TFPI-2 蛋白表達陽性者20例，陽性率為33.33%，2組差異具有統計學意義(P<0.01)。其中39例非肌層浸潤性膀胱癌組織中，陽性有16例，陽性率41.03%。21例浸潤性膀胱癌組織中，陽性只有4例，陽性率19.05%，2組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1A、圖1B、圖1C。

VEGF主要表達部位在細胞質或細胞膜，呈棕黃色。在正常膀胱組織中幾乎不表達，在膀胱癌組中呈高表達，尤其是在浸潤性膀胱癌組織。60例癌旁正常組織中，VEGF全部不表達。60例膀胱癌組織中，VEGF蛋白表達陽性者50例，陽性率為83.33%，2組差異具有統計學意義(P<0.01)。其中39例非肌層浸潤性膀胱癌組織中，陽性有31例，陽性率79.49%。21例浸潤性膀胱癌組織中，陽性有19例，陽性率90.48%，2組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1D、圖1E、圖1F。

2.2 TFPI-2mRNA、VEGF mRNA在癌旁正常組織、非肌層浸潤性膀胱癌組織、浸潤性膀胱癌組織中的表達情況。

浸潤性膀胱癌組和非肌層浸潤性膀胱癌組中得TFPI-2mRNA的表達均明顯低于癌旁組，而 VEGF mRNA的表達則均明顯高于癌旁組(癌旁組VEGF mRNA幾乎不表達)，差異具有統計學意義(P<0.01)；浸潤性膀胱癌組中，TFPI-2mRNA的表達低于非肌層浸潤性膀胱癌組，而VEGF mRNA的表達則高于非肌層浸潤性膀胱癌組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 TFPI-2mRNA和VEGF mRNA在不同膀胱組織中的表達比較

3 討論

膀胱腫瘤是我國泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，是一種直接威脅患者生存的疾病。手術成為膀胱腫瘤主要治療手段，還有放療、化療、介入等治療手段。盡管膀胱癌治療手段多種多樣，但仍不能改變膀胱癌復發率高的特性，尤其是浸潤性膀胱癌，容易出現復發、轉移。故目前除了研究手術、放療、化療方案等，如何降低膀胱腫瘤術后及放化療后的復發、轉移也成為研究熱點之一。

TFPI-2是一種絲氨酸蛋白酶抑制物，它可抑制多種蛋白酶的活性，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移[9]。研究發現它還可通過抑制新生血管的生成，從而抑制腫瘤增殖、浸潤、轉移[10、11]。本研究發現TFPI-2在癌旁正常組織中高表達，在膀胱癌組中呈低表達或不表達，且惡性程度越高，TFPI-2表達越低。這說明了TFPI-2可能與膀胱癌的發生、發展密切相關。

惡性腫瘤的發生、發展與血管的生成密切相關，血管生成可為腫瘤提供養分并為其去除代謝廢物，是腫瘤生長的必要條件[12、13]。VEGF是一種血管內皮分裂素，可通過促進血管內皮細胞分裂增殖從而促進血管生成；也可通過增加血管通透性，導致血漿成分外滲，從而引起腫瘤轉移[14]。由此可見VEGF與腫瘤發生、發展密切相關。本研究發現VEGF在正常癌旁組織中幾乎不表達，在膀胱癌組中呈高表達，尤其是在浸潤性膀胱癌組織中，提示VEGF可能與膀胱癌發生、發展密切相關。

本研究應用免疫組化和realtime PCR檢測TFPI-2和VEGF在膀胱癌中的表達情況，結果發現TPFI-2在膀胱癌的表達明顯低于癌旁正常組織，且浸潤性膀胱癌的表達低于非肌層浸潤性膀胱癌，差異有統計學意義。而VEGF的表達剛好相反，VEGF在正常癌旁組織中幾乎不表達，在膀胱癌組中呈高表達，且浸潤性膀胱癌的表達高于非肌層浸潤性膀胱癌，差異有統計學意義。該結果提示TFPI-2的低表達和VEGF高表達與膀胱癌的發生、發展密切相關。TFPI-2可能通過抑制VEGF的表達，從而抑制膀胱癌的發生、發展。

綜上所述，TFPI-2和VEGF與膀胱癌發生、發展密切相關，有望成為判斷膀胱腫瘤生物學行為及預后的重要指標。后期可通過TFPI-2基因轉染，甚至動物模型的建立，來進一步研究膀胱癌的發生、浸潤、轉移機制，可為膀胱癌的基因治療提供新的靶向和治療方案。