溫度對原料乳中分離的耐冷菌產胞外酶的影響

夏永軍， 張 峰， 宋 馨， 王光強， 艾連中， 熊智強

上海理工大學健康科學與工程學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093

耐冷菌在原料乳低溫貯藏、加工運輸過程中廣泛存在。原料乳作為乳制品生產的基本原料，在加工的不同階段，其耐冷菌的群落結構各不相同，例如未巴氏殺菌階段以假單胞菌等耐冷菌為主[1]。原料乳在灌裝和低溫儲存過程中最常發生耐冷菌大量污染，而機器上冷凝水和灌裝機不清潔也易造成污染[2]。原奶的快速冷卻和冷藏有利于原料乳中耐冷菌的生長，在巴氏殺菌前原料乳中耐冷菌生長可達到較高的數量，使牛奶產生異味。盡管非孢子形態的耐冷菌可通過巴氏殺菌殺死，但其產生的蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶等胞外酶能耐受巴氏殺菌甚至超高溫瞬時殺菌的溫度[3]，仍可以水解牛奶中的蛋白質、脂肪和卵磷脂等營養物質，導致牛奶產生腐臭、酸敗或肥皂味、苦味、奶油味等不良風味，導致產品品質顯著下降，嚴重影響乳制品的貨架期。

本課題組前期采用變性梯度凝膠電泳和高通量測序分析嬰幼兒配方奶粉生產過程中細菌群落結構變化和分布，發現原料乳階段主要的微生物污染為假單胞菌屬，而奶粉產品中主要菌群為乳球菌屬、鏈球菌屬、棲熱菌屬、不動桿菌屬和擬桿菌屬[4]。為探索原料乳中耐冷菌及其產胞外酶規律，本研究從原料乳樣品中篩選30株耐冷菌，進行16S rRNA菌種和耐熱蛋白酶aprX基因鑒定，分析溫度對其產胞外酶酶規律的影響，為原料乳質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

原料乳取樣自光明乳業股份有限公司，4 ℃冰箱放置4 d后在4 ℃低溫培養條件下分離篩選耐冷菌。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白棟10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，調節pH 7.2，去離子水定容至1 L。

LA培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1 g，脫脂粉1 g，去離子水定容至1 L。

1.3 耐冷菌的分離

參照辛亮報道的方法[5]，采用LB和LA培養基對原料乳樣品在4 ℃低溫培養條件下進行耐冷菌的分離。

1.4 耐冷菌16S rRNA和耐熱蛋白酶AprX基因的鑒定

將篩選出的耐冷菌分離純化后進行菌落PCR，采用XIONG等報道的PCR反應體系和程序條件[6]。引物SM2F(AAATCGATAGCTTCAGCCAT)和SM3R(TTGAGGTTGATCTTCTGGTT)用于鑒定耐熱蛋白酶AprX基因特異性引物[7]，引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1 492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)用于鑒定16S rRNA基因特異性引物[8]。PCR產物送至華大基因有限公司進行測序，獲得的序列在NCBI nr數據庫中進行Blast同源比對，確定耐冷菌的種類及AprX基因信息。

1.5 耐冷菌蛋白酶和脂肪酶酶活測定及其熱穩定性

將活化的耐冷菌2%接種分別接種在LA和LB培養基中，25 ℃培養2 d， 4 ℃ 8 000×g離心20 min，取上清分別采用國標GB/T 23527—2009和GB/T 23535—2009測定胞外蛋白酶和脂肪酶酶活，上清90 ℃處理5 min測定酶活的熱穩定性。

1.6 耐冷菌產酶能力的測定

耐冷菌菌株在15 mL UHT乳中采用4 ℃、25 ℃和37 ℃下分別培養5 d，取4 mL采用1.5中的方法測定蛋白酶和脂肪酶酶活。取1 mL發酵液在0.9%生理鹽水中梯度稀釋后，在平板上進行菌落計數。

1.7 數據統計

上述各實驗均重復3次，實驗數據用均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 原料乳中耐冷菌的分離鑒定

為探究原料乳加工階段中耐冷菌的影響，本研究利用LB和LA培養基從原料乳樣品中分離出30株在4 ℃下能生長的耐冷菌，菌株命名為Z1-Z15和P1-P15。對此30株耐冷菌進行菌種鑒定，16S rRNA測序比對發現，除P5為芽孢桿菌，其余29株都為假單胞菌(表1)，表明原料乳中耐冷菌主要為假單胞菌。XIONG 等[4]采用DGGE和高通量測序發現原料乳中微生物主要菌群為假單胞菌，與本研究的實驗結果一致。

大量研究報道假單胞菌能產生多種耐熱蛋白酶，其中標志性蛋白酶是AprX[9-11]，其保守結構域堿基序列長度為850 bp。本實驗選取分離的耐冷菌，采用特異性引物鑒定基因組中是否含有aprX基因。PCR結果表明Z1，Z2，Z3，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13和Z15共13株耐冷菌含有aprX(表1)。MARCHAND S等[12]從牛奶中篩選的55株假單胞菌中，42株檢測到aprX基因。這些結果均表明原料乳中較多的假單胞菌都含有aprX基因。基于此， DUFOUR D等[10]提出aprX基因可以用做檢測牛奶是否受到假單胞菌污染，但不能用來評估對牛奶影響的危害程度，且該基因在不同菌株中的表達水平也不一致。

表1 耐冷菌16S rRNA和耐熱蛋白酶AprX基因的鑒定

2.2 耐冷菌胞外脂肪酶和蛋白酶的熱穩定性

為研究分離的耐冷菌所產胞外酶的熱穩定性，對發酵液上清進行90 ℃加熱處理5 min后，大部分菌株所產胞外脂肪酶的酶活比40 ℃處理進一步提升(圖1A), 尤其是Z8、Z14、P4、P5和P8胞外脂肪酶活性提高1.88、2.20、2.00、2.25和3.67倍，表明原料乳中耐冷菌產生的脂肪酶具有很好的耐熱性，經過巴氏殺菌后仍然會對牛奶中的脂肪產生很大的破壞，產生酸敗。多數耐冷菌菌株所產胞外蛋白酶70 ℃處理比40 ℃處理的酶活更高，而P11、P15和Z7菌株在90℃處理后胞外蛋白酶的酶活也比40 ℃處理分別提高1.89、1.81和2.11倍(圖1B)，表明耐冷菌不但能夠分泌耐熱蛋白酶，而且熱處理能激活蛋白酶的活性。POFFé R等[13]從53份散裝牛奶樣品中分離出143株耐冷菌，其分泌的蛋白酶熱穩定性好，在80 ℃、90 ℃和100 ℃處理下蛋白酶的活性都增加，只有在55 ℃處理1 h和140 ℃處理2 min后酶活才下降。牛奶通常是巴氏殺菌，90 ℃處理5 min已高于普通巴氏殺菌處理條件，說明原料乳中如果存在耐冷菌，它們能夠產生的耐熱的蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，能耐受巴氏殺菌而不影響其酶活，進而可影響乳品品質。

A：脂肪酶的酶活及熱穩定性；B：蛋白酶的酶活及熱穩定性圖1 耐冷菌的胞外酶熱穩定性研究

2.3 不同溫度下耐冷菌的產酶能力

為研究耐冷菌在不同溫度下的產酶能力，本實驗在4 ℃、25 ℃和37 ℃培養條件下測定耐冷菌胞外蛋白酶的酶活(圖2)。4 ℃時Z9表現具有較好的蛋白酶活性，25 ℃所有耐冷菌數量達到峰值，而37 ℃蛋白酶活顯著增加。KARLSSON MA等[14]研究也發現夏季環境溫度升高會導致較高的貯藏溫度，耐冷菌數量也隨之增加。大部分耐冷菌特別是Z3在37 ℃表現出很高的活性(圖2C)，這可能是牛奶在37 ℃更易變質的原因。MENG L等[15]研究表明大多數耐冷菌2 ℃水解活性低于4 ℃、7 ℃和10 ℃，但也存在部分假單胞菌在2 ℃儲藏后具有更高的水解活性，表明培養溫度對酶活的影響與菌株特性相關，例如熒光假單胞菌產酶的最適產酶溫度為22 ℃，其次為7 ℃和32 ℃[16]。

在4 ℃、25 ℃和37 ℃培養條件下測定耐冷菌胞外脂肪酶的酶活(圖3)，25 ℃脂肪酶的產量要高于4 ℃和37 ℃，且25 ℃會有更多菌株產脂肪酶，表明低溫和高溫培養能有效降低產胞外脂肪酶的耐冷菌數量。不同菌株對溫度的敏感性具有顯著差異，Z11在4 ℃和25 ℃具有較高的脂肪酶活性，而在37 ℃則沒有檢測出脂肪酶活性。Z15在低溫下會產生脂肪酶，37 ℃卻沒有檢測出酶活，表明較高培養溫度能抑制其脂肪酶的產生。

A：4 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃圖3 不同溫度下耐冷菌產胞外脂肪酶能力

3 結論

從原料乳中共篩選出30株耐冷菌，包括29株假單胞菌和1株芽孢桿菌，表明假單胞菌在原料乳中的耐冷菌占據主導地位。耐冷菌所產胞外蛋白酶和脂肪酶具有較好的熱穩定性，特別是Z8、Z14、P4、P5和P8菌株所產脂肪酶和P11、P15和Z7菌株所產蛋白酶熱處理后酶活顯著增強，均提高1.8倍以上；分離的耐冷菌在4 ℃培養條件下能抑制耐冷菌的蛋白酶產生，而37 ℃培養條件下對脂肪酶產生影響較大，表明溫度對耐冷菌產胞外酶有明顯影響，且較低和較高的培養溫度能夠抑制耐冷菌的產酶能力。