植物多酚或黃酮類的添加量對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響和機理

張秀花， 楊 光， 楊 波

上海理工大學 健康科學與工程學院， 上海 200093

豬肉是我國居民中最主要的肉類消費品之一，且能夠給人提供豐富的蛋白質、礦物質和維生素等營養物質[1-2]。在日常生活中，豬肉的色澤也直接影響著消費者的購買欲及食欲。肌肉組織的pH、溫度、脂肪氧化程度及肌紅蛋白狀態等因素都會影響豬肉的色澤[3]。亞硝酸鹽常被用來作為肉制品的發色劑，使肉制品呈現穩定的紅色[4]。但亞硝酸鹽在酸性條件下可以與肉中的胺類物質發生亞硝基反應，轉化成具有強癌性的N-亞硝基化合物[5]。因此，如何改善肉制品的色澤且能降低亞硝酸鹽的殘留量是食品工藝中研究的一項重要內容。

目前，已有大量研究表明植物提取物中含有的多酚及黃酮類化合物對亞硝酸鹽具有一定的清除作用[6-8]。周亞軍等[6]研究發現竹葉提取物能夠改善低硝西式熏煮火腿的色澤，降低亞硝酸鹽殘留量。當添加質量分數為0.05%的竹葉提取物時，亞硝酸鹽殘留量最少，清除率為62.47%。郗遠[7]研究發現添加1%～3%的蔓越莓粉末能夠顯著降低腌制豬肉的亞硝酸殘留量，腌制9 d后，三個蔓越莓處理組與對照組相比亞硝酸鹽殘留濃度顯著減少16 mg/kg～82 mg/kg。王永麗[8]利用茶多酚、葡萄提取物及姜辣素來研究腌制培根風干儲藏過程中亞硝酸鹽殘留量的變化，研究表明在腌制時添加300 mg/kg的植物多酚(茶多酚和葡萄籽提取物)和生育酚，可以降低亞硝酸鹽殘留量，抑制其亞硝基化，控制N-二甲基亞硝胺的形成。已有研究表明：葡萄籽提取物中含有大量的原花青素，其抗氧化活性較高[9]；藍莓提取物的主要成分是花青素，其屬于酚類化合物中的類黃酮類[10]；而山楂提取物的主要成分為黃酮類[11]，三者都對亞硝酸鹽有一定的清除效果。

因此，為進一步改善豬肉亞硝酸鹽腌制品的色澤并降低亞硝酸鈉的殘留量，本文選用藍莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黃酮三種植物多酚或黃酮進行復配，通過添加三種不同質量分數的植物多酚或黃酮來探究對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響，并通過單因素試驗及響應面優化確定出這三種植物多酚或黃酮的適宜添加量，并對其影響色澤及亞硝酸鈉殘留量的機制進行初步探究，為加工肉制品提供一定的理論基礎和參考依據，進一步提高肉制品品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：中方肉：購于上海沃爾瑪超市，-18 ℃下冷凍貯存，待使用時將冷凍的豬肉于4 ℃下解凍12 h。葡萄籽提取物(原花青素含量≥95%)、藍莓提取物(含花青素25%)，山東圣嘉德生物科技有限公司；山楂提取物(含山楂黃酮80%)，福建匯天生物藥業有限公司；亞硝酸鈉(食品級)，杭州龍山化工有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準品(純度≥97%)，上海麥克林生化科技有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)、乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，分析純，均在上海國藥集團購買。

儀器：ER-RD7000CN東芝微波烤箱，泰國東芝電器制造有限公司；L5S紫外分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司；CS-600A分光測色儀，杭州彩譜科技有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋，上海華連醫療器械有限公司；LC-MSH-PRO恒溫磁力攪拌器，邦西儀器科技(上海)有限公司，TDL-80-2B低速離心機，上海安亭科學儀器廠；Nicoletis10傅里葉變換紅外光譜儀，美國THERMO FISHER公司。

1.2 方法

1.2.1原料肉的處理

將解凍后的豬肉切成大小為3 cm×2 cm×1.5 cm的肉片，加入質量分數為0.015%的亞硝酸鈉，一定質量分數的藍莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黃酮，加入50 mL水，攪拌均勻后放在4 ℃的冰箱中腌制12 h，將腌制后的豬肉用過熱蒸汽進行加熱，并設定好加熱溫度150 ℃，加熱時間25 min，待豬肉加熱完成后，迅速取樣，冷卻至室溫時待測。

1.2.2a*的測定

將肉切成大小為2 cm×1 cm ×1 cm的肉片，放在白色背景板上，使用分光測色儀測定其紅度值(a*)[12]。

1.2.3亞硝酸鈉殘留量的測定

按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》分光光度法進行測定[13]。

1.2.4植物多酚或黃酮類的單因素試驗

以豬肉亞硝酸鈉腌制品紅度值a*及亞硝酸鈉殘留量為指標，探究不同質量分數的植物多酚或黃酮(藍莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黃酮)對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響，設計三因素五水平的單因素試驗，因素水平如表1所示。樣品處理同1.2.1。

表1 單因素試驗因素水平表

1.2.5植物多酚或黃酮類的響應面法優化

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計進行優化分析，以藍莓花青素、葡萄籽原花青素及山楂黃酮為影響因素，以豬肉亞硝酸鈉腌制品紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量為響應值，并設計三因素三水平的響應面試驗，因素水平見表2所示。樣品處理同1.2.1。

表2 響應面設計因素水平表

1.2.6硫代巴比妥酸值(TBARS)的測定

參照唐彬等[14]測定TBA的方法并稍作修改。稱取10 g肉樣，并使其充分攪碎。加入50 mL的7.5%三氯乙酸混合液(含0.1% EDTA溶液)，搖勻，置于磁力攪拌器上50 ℃攪拌30 min，混合物用雙層濾紙過濾。取濾液 5 mL，加 5 mL 0.02 mol/L TBA 溶液，100 ℃沸水浴中保持40 min，取出后用流動自來水冷卻10 min，用紫外可見分光光度計在 532 nm 處測定反應溶液的吸光值。通過與標準曲線對照計算出TBA值，其結果用mg MDA/kg表示。

1.2.7肌紅蛋白含量及高鐵肌紅蛋白相對含量測定

參考KRZYWICKI[15]的方法并稍作修改：稱取5 g待測豬肉糜，加入25 mL濃度為0.04 mol/L、pH 6.8的磷酸緩沖液，并在室溫下用恒溫磁力攪拌器1 500 r/min 攪拌5 min。攪拌完成后，將其置于冰水浴中，靜置1 h，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，過濾，采用紫外分光光度計分別在525 nm、545 nm、565 nm和572 nm波長處測量其吸光度。計算肌紅蛋白濃度及高鐵肌紅蛋白相對含量。

肌紅蛋白濃度/(mmol/L)=-0.166A572 nm+0.086A565 nm+0.088A545 nm+0.099A525 nm

(1)

高鐵肌紅蛋白/%=(-2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100

(2)

式(2)中：R1、R2、R3分別為吸光度比值A572 nm/A525 nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。

1.2.8傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)測定

參考張登科等[16]的方法并稍作修改，取加熱處理好的豬肉樣品冷凍干燥后，采用KBr壓片法，置于傅里葉變換近紅外光譜上進行掃描，波長范圍為4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.9數據處理與分析

每組試驗重復3次，數據以平均值±標準差表示。運用Origin 2019b軟件繪圖，數據采用SPSS Statistics 25 軟件進行統計學分析，用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計與分析。

2 結果與討論

2.1 藍莓花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

由圖1可知，當藍莓花青素的添加量在0.01%～0.05%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*呈上升趨勢(P<0.05)。當藍莓花青素的添加量在0.04%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*為9.01，此時得到的豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤較適宜、穩定性較好。當其添加量大于0.04%時，a*的變化沒有顯著性差異。隨著藍莓花青素添加量的增加，亞硝酸鈉殘留量呈下降趨勢(P<0.05)。當藍莓花青素的添加量0.04%，亞硝酸鈉殘留量降低至1.66 mg/kg。這一結果與魏萌等[17]研究的一致，藍莓花青素屬于酚類化合物中的類黃酮類[10]，這些物質可以與亞硝胺前體物質發生氧化還原反應，從而降低了肉制品中的亞硝酸鹽殘留量，抑制了亞硝胺的形成[18]。所以，綜合考慮以藍莓花青素添加量0.04%為最適添加量。

圖1 藍莓花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

2.2 葡萄籽原花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

由圖2可知，葡萄籽原花青素添加量在0.02%～0.1%時。隨著葡萄籽原花青素添加量的增加，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*呈上升趨勢(P<0.05)，當加入質量分數為0.06%的葡萄籽原花青素時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*達到8.96，且與對照組相比，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值明顯加深。當葡萄籽原花青素的添加量大于0.06%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度過深而影響其食用價值。亞硝酸鈉殘留量隨著葡萄籽原花青素添加量的增加呈下降趨勢(P<0.05)。當葡萄籽原花青素的添加量為0.06%時，繼續增加葡萄籽原花青素的用量，亞硝酸鈉殘留量降低不顯著。葡萄籽原花青素是多酚類物質[19]。原花青素中含有大量的酚羥基，酚羥基可提供活潑性氫離子與亞硝酸鹽反應，可將亞硝酸鹽還原成一氧化氮,從而減少了亞硝酸的殘留并提高肉的紅色[20]。因此，綜合考慮以葡萄籽原花青素的添加量0.06%為最適添加量。

圖2 葡萄籽原花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

2.3 山楂黃酮對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

由圖3可知，當山楂黃酮的添加量在0.01%～0.05%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*呈上升趨勢(P<0.05)，而亞硝酸鈉殘留量隨著山楂提取物添加量的增加而呈下降趨勢(P<0.05)。這與劉星[21]研究的結果一致。當山楂黃酮的添加量在0.03%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*已達到8.93，亞硝酸鈉殘留量降低至2.20 mg/kg，當其添加量大于0.03%時，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*與亞硝酸殘留量變化不顯著，考慮到節約成本且豬肉的顏色已達到理想狀態，因此，山楂黃酮的最適添加量為0.03%。

圖3 山楂黃酮對豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤及亞硝酸鈉殘留量的影響

2.4 響應面優化試驗結果與分析

以藍莓花青素(A)、葡萄籽原花青素(B)、山楂黃酮(C)為自變量，豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*(Y1)和亞硝酸殘留量(Y2)為響應值進行RSM優化，其結果見表3。

表3 響應面設計及結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行響應面分析，其顯著性如表4和表5所示，對紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量進行回歸分析，擬合得到三元二次回歸方程：

表4 豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*響應面方差分析表

表5 亞硝酸鈉殘留量響應面方差分析表

Y1=8.97+0.34×A+0.51×B+0.33×C+0.28×AB+0.14×AC+(7.5×10-3)×BC-0.25×A2-0.33×B2-0.052×C2。

Y2=1.57-0.33×A-0.57×B-0.21×C-0.15×AB-0.042×AC+0.048×BC+0.27×A2+0.48×B2+0.082×C2。

表4和表5分別是對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量回歸模型進行的方差分析。由表4可知，模型P<0.000 1<0.01，說明Y1模型差異為極顯著；失擬項P=0.225 1>0.05，說明相對于純誤差，失擬項不顯著；同理，由表5可知，模型P<0.000 1<0.01，說明Y2模型差異為極顯著；失擬項P=0.232 7>0.05，說明相對于純誤差，失擬項不顯著；各模型的決定系數分別為R2=0.980 1、0.992 8，均較接近于1，說明該模型與實際數據擬合良好[22]，能夠正確地反應出豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*、亞硝酸鈉殘留量與葡萄籽原花青素、藍莓花青素和山楂黃酮的關系。

通過比較F值發現，三個因素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*及亞硝酸鈉殘留量的影響的顯著性大小為葡萄籽原花青素>藍莓花青素>山楂黃酮。利用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行分析，當亞硝酸鈉殘留量處于最低水平時，且豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*居于合適范圍內，植物多酚或黃酮類優的化化工藝如下：當藍莓花青素的添加量為0.045%、葡萄籽原花青素的添加量為0.069%、山楂黃酮的添加量為0.025%，得到的豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸殘留量的理論值分別為9.10 mg/kg和1.40 mg/kg。

通過響應面優化分析，得出藍莓花青素、葡萄籽原花青素與山楂黃酮三個因素及其交互作用對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*及亞硝酸鈉殘留量的影響如圖4所示。

(a) 藍莓花青素與葡萄籽原花青素交互作用

(b) 藍莓花青素與山楂黃酮交互作用

(c) 葡萄籽原花青素與山楂黃酮交互作用圖4 各因素交互作用對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量的影響

響應面曲面坡度陡峭程度可以反映出各因素對響應值的影響程度大小，坡度越陡，對響應值的影響越大[23]。由圖4(a)可知，當固定山楂黃酮的添加量為0.03%時，葡萄籽原花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量的影響程度大于藍莓花青素；同理，由圖4(b)可知，當固定葡萄籽原花青素添加量為0.06%時，藍莓花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量的影響程度大于山楂黃酮；由圖4(c)可知，當固定藍莓花青素添加量為0.04%時，葡萄籽原花青素對豬肉亞硝酸鈉腌制品的紅度值a*和亞硝酸鈉殘留量的影響程度大于山楂黃酮。

2.5 響應面試驗最優條件驗證

根據實際情況將工藝調整為：藍莓花青素添加量為0.045%、葡萄籽原花青素添加量為0.069%、山楂黃酮添加量為0.025%，在此條件下進行驗證，做三次重復試驗，結果取平均值，測得的實際紅度值a*為9.18，亞硝酸鈉殘留量1.56 mg/kg，該值與理論值相差較小，表明該模型具有可靠性。

2.6 植物多酚或黃酮類對豬肉硫代巴比妥酸值(TBARS)的影響

豬肉的色澤及亞硝酸鈉殘留量受到脂質氧化程度的影響[24]，丙二醛是動物脂質氧化分解的最終產物，與硫代巴比妥酸(TBA)反應生成粉紅色物質，其TBA值越大，表明豬肉氧化程度越高[25]。由圖5可知，與對照組相比，所有試驗組的TBA值較低，且復配植物多酚或黃酮類的TBA值低于單一植物多酚與黃酮，這與徐暢等[26]研究的結果一致，復配的植物多酚或黃酮的TBA值為0.14 mg MDA/kg。TBA值降低可能是由于植物多酚或黃酮類中含有的酚羥基與自由基相結合從而中斷了自由基的鏈式反應，減少了氧化產物的產生[27]。可見，植物多酚或黃酮類對豬肉的脂質氧化有較好的抑制作用。

圖5 植物多酚或黃酮類對豬肉硫代巴比妥酸值(TBARS)的影響

2.7 植物多酚或黃酮類對豬肉中肌紅蛋白與高鐵肌紅蛋白含量的影響

降低肉中肌紅蛋白血紅素中鐵原子的氧化，減少肌紅蛋白向高鐵肌紅蛋白的轉化是維持豬肉色澤穩定性的關鍵[28]。由圖6(a)與(b)可知，與對照組相比，復配植物多酚或黃酮類的肌紅蛋白濃度較高，高鐵肌紅蛋白含量最低。復配植物多酚或黃酮類比單一植物多酚或黃酮的使用效果更加明顯，說明復配的植物多酚或黃酮可以有效改善肉制品的色澤穩定性。由于亞硝酸鈉在肉中乳酸的作用下生成亞硝酸，亞硝酸即使在室溫下也很不穩定，分解產生亞硝基，亞硝基很快與肌紅蛋白作用生成鮮艷的紅色亞硝基肌紅蛋白[29]。植物多酚或黃酮類中含有的酚類物質具有抗氧化活性，既可以防止肌紅蛋白的氧化，使其生成更多的亞硝基肌紅蛋白，使豬肉呈色效果更佳，又可以發揮助色作用將高鐵肌紅蛋白還原成肌紅蛋白[30]。

(a) 肌紅蛋白

(b) 高鐵肌紅蛋白圖6 植物多酚或黃酮類對豬肉中(a)肌紅蛋白與(b)高鐵肌紅蛋白含量的影響

2.8 紅外光譜分析

為了研究豬肉樣品在用復配植物多酚或黃酮處理前后結構是否發生變化，測得豬肉的紅外光譜如圖7所示。

圖7 對照組與復配植物多酚或黃酮紅外光譜圖

由圖7可知，在 2 920 cm-1附近的吸收峰則是-CH的伸縮振動[31]。在1 500 cm-1～1 800 cm-1波段為蛋白質酰胺I、II帶的特征吸收峰[32]。從圖中可以看出，與對照組相比，在1 720 cm-1附近處的吸收峰變寬、強度增強以及1 750 cm-1附近的吸收峰發生偏移、吸收峰強度也在增強，這說明復配植物多酚或黃酮類的添加引起了豬肉中蛋白質二級結構的變化。

3 結論

通過單因素和響應面優化試驗，得出了復配植物多酚或黃酮類的優化參數：當藍莓花青素添加量為0.045%、葡萄籽原花青素添加量為0.069%、山楂黃酮添加量為0.025%，得到的a*為9.18，亞硝酸鈉殘留量1.56 mg/kg，此時得到的豬肉亞硝酸鈉腌制品色澤穩定性較好，且亞硝酸鈉殘留量較低。通過對豬肉硫代巴比妥酸值脂質氧化程度與肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白含量的分析，可以看出復配植物多酚或黃酮類相較于單一植物多酚或黃酮有更好的抗氧化效果，能夠抑制脂質的氧化和減少高鐵肌紅蛋白的生成量，從而使豬肉制品賦予良好的色澤。通過紅外光譜的分析結果可知，復配的植物多酚或黃酮類的添加引起了豬肉中蛋白質二級結構的變化，因此，植物多酚或黃酮類不僅能夠有效改善豬肉亞硝酸鈉腌制品的色澤，同時也可降低亞硝酸鹽的殘留，為加工肉制品的安全提供理論依據。