蔓越莓及蔓越莓制品體外抑菌試驗的測定與分析

張 波， 張莉敏， 張榮桂

1.棗莊市市場監管綜合服務中心，山東 棗莊 277000；2.棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 棗莊 277000

蔓越莓又稱蔓越橘，是杜鵑花科越橘屬的常綠小灌木矮蔓藤植物，主要生長在北半球的涼爽地帶酸性泥炭土壤中[1]。果實為長2 cm～5 cm 的卵圓形漿果，吃起來有重酸發澀的口感[2]。蔓越莓的種植主要集中在美國北部，我國黑龍江地區也有種植蔓越莓。但現在全球90%以上的蔓越莓產品仍在北美出售和消費[3]。國內外學者對蔓越莓成分及功能研究很多，如蔓越莓含大量的維生素C(Vc), Vc的含量為普通水果的6倍，具有抗氧化[4]、預防血小管疾病[5]、促進機體生長發育、預防壞血病[6]、降血壓、預防尿道感染[7]、降低齲齒[8]、牙周炎發生率[9]、抑制胃幽門螺桿菌[10]等功能。國內外報道的多為蔓越莓汁、蔓越莓提取物、蔓越莓壓片糖果、蔓越莓蜜餞等制劑的預防疾病功效及抑菌性概述或研究進展之類的文章[11]，國內少見有對蔓越莓及制品進行體外抑菌效力檢測的試驗科研報告。本研究選取了細菌以大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、副傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌為試驗菌，真菌以白色念珠菌、黑曲霉為試驗菌，厭氧菌以生孢梭菌為例，對蔓越莓漿果、蔓越莓干、蔓越莓提取物、蔓越莓蜜餞進行體外抑菌效力檢測研究，為蔓越莓的保健預防疾病功能提供理論依據。

1 材料、儀器及方法

1.1 材料

A、蔓越莓漿果(儲存日期：20211022，北京市通州興貿三街冷運庫)； B、蔓越莓干(20211112,棗莊市食品藥品檢驗檢測中心自制 )；C、蔓越莓提取物(100 g/袋，含花青素25%，批號：20211125，漢中漢溯源生物科技有限公司)；D、蔓越莓蜜餞(批號： 20210921；山東德寶食品有限公司)；E、蔓越莓蜜餞(批號：20210907.11 B，山東省棗莊市大潤發超市)。

1.2 儀器

PGL3002電子天平，艾德姆衡器(武漢)有限公司；DHP9082電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；LRH150電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；GR60DF立式壓力滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；80系列離心沉淀器，上海手術器械廠；ALN-50S菌落計數器，上海昂尼儀器儀表有限公司；Sevenmulti酸度計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XW80A混合器，上海醫科大學儀器廠；YT-761勻漿儀，杭州盈天科學儀器有限公司。上述儀器均在檢定有效期內。

1.3 方法

1.3.1試驗菌種 大腸埃希氏菌(批號：201209,Escherichiacoli,縮寫：Eco)；銅綠假單胞菌(批號：201117,Pseudomonasaeruginosa, 縮寫：Pae)；乙型副傷寒沙門氏菌(批號：201212,SalmonellaparatyphiB, 縮寫：Spa)；金黃色葡萄球菌(批號：201229,Staphylococcusaureus, 縮寫：Sau)；枯草芽孢桿菌(批號：201016,Bacillussubtilis, 縮寫：BSu)；生孢梭菌(批號：201030,Clostridiumsporogenes, 縮寫：Csp)；白色念珠菌(批號：201226,Candidaalbicans, 縮寫：Cal)；黑曲霉(批號：201203,Aspergillusniger, 縮寫：Ani)。以上8種試驗菌均購自北京三藥科技開發公司，均通過中國醫學細菌保藏管理中心(CMCC)溯源檢查。以下文中內容菌種名稱均用英文縮寫。

1.3.2培養基 營養瓊脂(批號：200807)；胰酪蛋白胨瓊脂(批號：200709，縮寫TSA)；沙氏葡萄糖瓊脂(批號：210609，縮寫SDA)；生產廠家均為北京陸橋技術股份有限公司。其他材料：0.75% 無菌生理鹽水、0.5 mg/L 二氧化氯溶液、無菌平面皿(規格：直徑90 mm)、無菌牛津杯(內徑6 mm，高10 mm)。

1.3.3各供試品供試液的制備 將各供試品外部清潔消毒，分別稱適量，于無菌勻漿罐內粉碎，根據產品的特點，加適量無菌生理鹽水將各供試品進行打漿、離心、過濾除菌后[12]，稀釋成1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀釋級的溶液(g/mL)，備用。

1.3.4菌懸液的制備 取上述8種試驗菌，置于相應培養基中培養，然后用無菌生理鹽水稀釋制成(1～5×106) CFU/mL濃度的菌懸液備用[13]。

1.3.5抑菌實驗 牛津杯法[14],往9 cm的無菌平皿中傾注20 mL滅菌后的不同培養基，凝固后，吸取0.5 mL各試驗菌菌懸液置于凝固后的平皿中，均勻涂布，然后平皿中等距放置3個牛津杯，其中1個牛津杯注入1∶2稀釋級的各供試品溶液；另一個牛津杯注入無菌生理鹽水做空白對照；第三個牛津杯注入0.5 mg/L 二氧化氯溶液(因其具有廣譜、高效的殺菌能力[15]，故選擇之)為陽性參照物對照；牛津杯放置在培養箱，37 ℃培養24 h，生孢梭菌用營養瓊脂，厭氧環境，37 ℃培養24 h，白色念珠菌和黑曲霉用SDA培養基，在25 ℃分別培養72 h，120 h[16]，然后取出平皿測定抑菌圈直徑。

1.3.6抑菌圈法測最小抑制濃度(MIC)[17]將1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀釋級供試品溶液同樣采用牛津杯法實驗，進行抑菌圈直徑測定，直到牛津杯周圍沒有明顯的抑菌圈為止，確定最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 抑菌效果分析見表1

表1 抑菌效果比較研究*

由表1可知，1∶2稀釋級的各供試品對不同的試驗菌都有不同程度的抑制作用，蔓越莓提取物對各種試驗菌的抑菌能力最強，其次為蔓越莓漿果，蔓越莓干和蔓越莓蜜餞的抑菌作用相對較弱。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)，結果見表2

表2 最低抑菌濃度研究比較(以抑菌圈直徑表示，mm)

由表2可知，對同種細菌的抑制作用，蔓越莓提取物抑菌效果最強。蔓越莓提取物對大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌的MIC為1∶15稀釋級；對白色念珠菌和黑曲霉的MIC為1∶10稀釋級。

2.3 對非潔凈區環境空氣中微生物的抑菌效果檢測

分別取1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀釋級各供試品溶液0.5 mL,均勻涂布于TSA瓊脂、SDA平板的表面，打開平皿蓋，暴露非潔凈區環境中10 min，TSA瓊脂平板置于35 ℃培養24 h，SDA平板25 ℃培養72 h，同時以不加供試品的瓊脂平板同法做空白對照實驗，觀察菌落生長情況，結果見表3。

表3 非潔凈區環境菌落數(CFU)

表3表明不同稀釋級的各供試品對空氣中的微生物也有一定的抑菌性。蔓越莓提取物的抑菌效果最好，其次為蔓越莓漿果。

表格說明① 表1、表2、表3、表4中的A為蔓越莓漿果，B為蔓越莓干，C為蔓越莓提取物，D為蔓越莓蜜餞(20210921)，E為蔓越莓蜜餞(20210907)，F為0.5 mg/L二氧化氯溶液，G為0.75%無菌生理鹽水；② 表格里的1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、 1∶10、1∶15、1∶30指的是各供試品稀釋倍數，換算成濃度(單位：g/mL)相應為0.5、0.25、0.125、0.166 7、0.1、0.066 7、0.033 3, 四個表格里數值均為3次平行試驗的平均值；③ 表1和表2中各抑菌圈直徑數值包含牛津杯的直徑6 mm。“-”指未測定；表4中測pH的室溫為25 ℃，生理鹽水為稀釋液；④ 表格里的TSA、SDA均為培養基縮寫。

3 討論

在本研究中，蔓越莓提取物對各種試驗菌的抑菌能力最強，這可能和它的低pH有關(見表4)。試驗測定蔓越莓提取物在1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀釋級的pH約為2.3～2.7，同稀釋級蔓越莓其他制品pH約為2.4～3.2。據報道，(1) 極低的pH值可以抑制大部分致病菌的生長[18]；(2) 有觀點認為A型原花青素是蔓越莓果中的主要抗菌成份，抗菌機制可能為：①A型原花青素與鐵離子螯合抑制細菌生長，②阻斷其他金屬離子的作用影響細菌的代謝，③抑制氧化磷酸化，影響細胞膜的穩定性[19]。也有研究者發現原花青素在體外能有效抑制細菌黏附作用[20]，抗黏附濃度為≥60 μg/mL[21]，從而起到抑菌作用。有作者聲稱質量優良的100 g蔓越莓漿果中含原花青素約62.7 mg。但原花青素性質不穩定，易被氧化[22]，溫度、pH值、光照、糖等外在因素都會對它產生影響[23]。其中溫度影響最大[24]，一般情況下，天然色素在低溫或干燥狀態下較穩定，升溫或加熱易氧化變色[25]。因此含花青素的食品如果儲存、加工方式不當，花青素含量會降低[26]。蔓越莓提取物中純花青素含量比較高，所以抑菌能力強于其他制品，蔓越莓漿果因未經過加工處理，花青素成分未被破壞，所以抑菌能力也比其他制品強。但從總體上看，蔓越莓提取物及蔓越莓制品對各種試驗菌都有不同程度的抑制作用，因此未來蔓越莓也可能成為一種天然的抗菌劑。在我國，有大量的天生帶有抑菌能力的特殊植物[27]，隨著我國對營養與食品、藥品安全的關注度越來越高，人們也越來越傾向于食用天然的、安全的功能型食品或藥品。利用蔓越莓的抑菌性，可以將蔓越莓開發成多系列產品，如用作天然防腐劑、天然酸堿調節劑、抗菌藥物、保健食品或添加劑等,但仍需要更多的研究驗證。

表4 不同稀釋級各供試品的pH值

另外，從本次實驗可知，在對有過強的酸性、堿性或強抑菌性的食品進行微生物檢驗時，除了對食品的酸性、堿性進行中和外，也有必要按國家藥典委員會規定的方法對食品的抑菌性進行去除[28]，對該類食品的微生物檢驗方法進行驗證實驗，以確認所采用的方法適合該產品的微生物計數，這樣得到的檢驗數據才真實準確。