冷藏菲律賓蛤仔活體中優勢菌的分離鑒定、生長特性與致腐能力分析

楊 溢， 王 欣

上海理工大學健康科學與工程學院 食品質量與安全研究所， 上海 200093

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)為一種海水貝類，屬軟體動物門、雙殼綱、簾蛤目、簾蛤科，俗稱花蛤。因其味道鮮美，營養豐富，低脂高蛋白，富含多種微量元素而深受消費者喜愛，是我國主要的海產經濟貝類之一[1]。但受生長環境和濾食習慣的影響，鮮活菲律賓蛤仔中微生物數量較多，組成復雜，這導致菲律賓蛤仔在貯藏期間極易因微生物的生長及酶的作用而造成品質劣變。有調查對上海市生食貝類水產品安全性進行了半定量風險評估，顯示貝類水產品中副溶血性弧菌平均檢出率為43.7%，過量使用會危害人體健康[2]。

雖然低溫冷藏是抑制微生物的生長及酶的作用，延長鮮活水產品貨架期的有效方法之一[3-4]。但研究表明，鮮活水產品在低溫保藏過程中仍會因微生物的生長而發生腐敗變質。例如，李念等[5]的研究發現羅氏沼蝦在冷藏過程中的菌落總數隨時間延長而顯著增加，冷藏3 d后即超過6 lg(CFU/g)，使蝦體發生腐敗變質；馬錦濤等[6]的研究證明低溫保藏減緩了金槍魚片的腐敗速度，但菌落總數仍逐漸增加，且在第6 d達到7 lg(CFU/g)，使魚片失去食用價值；CHEN H B等[7]研究了不同產地的牡蠣腮中微生物數量與腐敗的關系，發現其初始菌落總數為3.1～4.5 lg(CFU/g)，而冷藏8 d后則顯著上升至7.8～8.8 lg(CFU/g)到達貨架期終點。因此，對鮮活水產品冷藏過程中的腐敗微生物進行研究是提高其品質，延長貨架期的重要基礎。

另一方面，隨著保藏時間的延長，鮮活水產品中的菌相也會發生變化，其中，一部分數量較多，具有最適生活力的微生物菌群在鮮活水產品的腐敗變質過程中發揮著主要的作用，這部分微生物被稱為該類產品的特定腐敗菌(specific spoilage organism, SSO)[8]。例如，趙宏強等[9]對冷藏鱸魚片的優勢腐敗菌進行了研究，發現冷藏鱸魚的優勢腐敗菌主要為希瓦氏菌屬與假單胞菌屬；而于淑池等[10]綜合貯藏末期所占比例及致腐能力結果確定腐敗希瓦氏菌為冷藏卵形鯧鲹的優勢腐敗菌；CAO R等[11]研究發現太平洋牡蠣中的優勢微生物為假單胞菌(22%)和弧菌(20%)，且隨著貯藏時間的增加，假單胞菌的比例明顯增加；MADIGAN TL等[12]則發現假單胞菌屬和弧菌屬在去殼牡蠣變質過程中起重要作用。因此，特定腐敗菌是造成產品腐敗的主要原因，對特定腐敗菌的研究可以為后續進行針對性的抑菌保鮮提供參考依據。然而，文獻調研表明，已有研究多圍繞菲律賓蛤仔的加工保藏方法開展，而對其冷藏過程中的優勢腐敗菌的研究相對較少。

基于以上分析，本研究擬采用傳統的培養方法重點對菲律賓蛤仔冷藏過程中的腐敗菌進行分離及鑒定，并通過控制溫度、pH、鹽濃度和貝汁濃度來研究不同條件對腐敗菌生長特性的影響，最后比較腐敗因子進而判斷致腐能力確定優勢腐敗菌，旨在為控制鮮活菲律賓蛤仔冷藏過程的品質劣變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

鮮活菲律賓蛤仔，原產地遼寧省丹東市，購于上海壹佰米網絡科技有限公司。低溫鹽水冷藏運輸，半小時內送達實驗室后置于冰箱冷藏(4 ℃)備用。

平板計數瓊脂(PCA)、溶菌肉湯(LB)固體及液體培養基、革蘭氏染液試劑盒、氧化酶試紙等均購自青島海博生物技術有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸、磷酸緩沖液、三氯乙酸、氧化鎂等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

GHP-9080型隔水式恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；VD-850型桌上式潔凈工作臺,蘇州滬凈凈化有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司； 3-18R醫用離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司；Nikon ECLIPSE E200MV生物顯微鏡，上海尼康儀器有限公司；URT210-C多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；K1100全自動凱氏定氮儀，海能未來技術有限公司；FP-1100-C生長曲線儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

首先，對鮮活菲律賓蛤仔4 ℃冷藏過程的感官評分、菌落總數及揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)進行分析；在對其中培養過程中占比較多，形態顯著的菌株進行分離、純化及鑒定的基礎上，進一步研究不同因素對幾種腐敗菌的生長特性的影響，最后還分析了各菌株的致腐能力，從而確定冷藏鮮活菲律賓蛤仔中的優勢腐敗菌。

滅菌貝汁的制備: 參照宋紹華等和PARLAPANI F F等[13-14]的方法制備滅菌貝汁，將新鮮菲律賓蛤仔先用無菌水清洗、瀝干后用潔凈小刀去殼取貝肉。將貝肉絞碎后按肉∶水=1∶2(m/v)的比例加蒸餾水煮沸15 min，冷卻后置于冰箱中靜置過夜，以除去表層浮油；8 000 r/min離心10 min后，取上清液121 ℃， 20 min滅菌，冷至室溫后4℃保存備用。

1.3 分析方法

1.3.1菲律賓蛤仔感官評分

由12名實驗室人員組成感官評定小組，依據表1綜合評定樣品的感官得分。

表1 菲律賓蛤仔感官評分標準評價表

1.3.2菌落總數及揮發性鹽基氮(TVB-N)測定

參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗:菌落總數測定》進行菌落總數的測定[15]。參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》進行TVB-N的檢測[16]。

1.3.3腐敗菌的分離及鑒定

在冷藏過程中，每隔1 d選取菌落數在30～300的平板，挑取其中占比較多，形態顯著的菌落進行平板劃線分離及純化傳代培養，并進行菌落形態革蘭氏染色、氧化酶及過氧化氫酶試驗。在此基礎上，參照鄭瑞生等[17]對即食鮑魚腐敗菌鑒定的方法，進行分子生物學鑒定[18]，具體步驟如下：

菌落PCR：先取2 mL離心管，加10 μL(雙蒸水)ddH2O，再用槍頭挑起一個菌落加入其中，吹吸混勻，待用。PCR 擴增反應體系為模板(菌液)1.0 μL、ddH2O 10.5 μL、引物27F 0.5 μL、引物1492R 0.5 μL、PSIS 12.5 μL，將其振蕩混合均勻后上機。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min后，98 ℃持續變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。隨后，取PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并將純化后的16S rDNA序列送上海華大基因有限公司進行測序，登陸NCBI網站進行同源性分析。

1.3.4不同因素對腐敗菌生長的影響

調整菌液濃度為107CFU/mL，選擇LB液體培養基，研究溫度、pH、NaCl濃度及添加貝汁對各腐敗菌株的生長狀況的影響。具體如下：

(1) 溫度：

在無菌96孔板中分別加入20 μL不同腐敗菌的菌液，再加入180 μL滅菌 LB液體培養基后，分別置于25 ℃、30 ℃和37 ℃下培養，測定培養初始(0 h)和24 h時的OD600 nm，計算各組的ΔOD600 nm值 (ΔOD600 nm=OD600 nm(培養24 h)-OD600 nm(初始))，分析培養溫度對各腐敗菌株生長的影響[19]。

(2) pH：

LB液體培養基滅菌前用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調pH分別至6.0、7.0、8.0，孔板裝樣比例及量不變，培養溫度為37 ℃，測定培養初始(0 h)和24 h時的OD600 nm，計算各組的ΔOD600 nm值，分析體系的pH對各腐敗菌株生長的影響。

(3) NaCl濃度：

使LB液體培養基中的NaCl濃度分別為1%、2%、3%和6%，裝樣比例及量不變， 培養溫度為37 ℃，測定培養初始(0 h)和24 h時的OD600 nm，計算各組的ΔOD600 nm值，分析NaCl濃度對各腐敗菌株生長的影響。

(4) 貝汁濃度

使LB液體培養基中的滅菌貝汁濃度分別為0%、5%、10%，裝樣比例及量不變，利用FP-1100-C全自動生長曲線儀檢測各菌株24 h的生長情況，進而將收集到的數據通過Com Base網站進行生長動力學分析。所得到的生長動力學參數主要有菌液樣本的初始濃度lg值(lgN0)、 37 ℃下培養24 h后菌液樣本的末期濃度lg值(lgNmax)、 生長延滯期(Lag/h)、 最大比生長速率(μmax/ h-1)，用回歸系數(R2，越接近1，模型擬合度越高)、均方誤差(MSE)對模型的準確性進行評價。

1.3.5不同菌株腐敗能力的比較

調整菌液濃度為107CFU/mL，各取0.5 mL菌液與50 mL無菌貝汁混勻后， 4 ℃冷藏保存，分別在24 h和72 h時取樣液進行菌落總數和TVB-N的測定，參照許振偉等[20]的方法，以腐敗代謝產物產量因子(YTVB-N/CFU)為評價指標，對7株菌的腐敗能力進行定量分析，YTVB-N/CFU的計算公式如下:

(1)

式中:(TVB-N)0、(TVB-N)s分別表示24 h和72 h的TVB-N含量，mg/100 mL，N0、Ns分別表示24 h和72 h的菌落總數，CFU/g。

1.4 數據處理

試驗均為三次平行三次重復，采用 Microsoft Excel 2019 和 SPSS 26.0 對數據進行分析，采用 ANOVA 進行組間差異顯著性分析(p<0.05)。采用 Origin2018 繪圖。

2 結果與討論

2.1 菲律賓蛤仔冷藏過程中菌落總數，感官評分及TVB-N的變化

2.1.1菌落總數及感官評分的變化

微生物的生長是導致鮮活水產品腐敗的主要原因，一般可用菌落總數反映其受微生物污染的程度。感官評分則可以反映食品的品質優劣及其可食用性。菲律賓蛤仔冷藏過程中菌落總數和感官評分的變化如圖1所示。

圖1 菲律賓蛤仔冷藏過程中菌落總數和感官評分的變化

圖1表明，隨冷藏時間的延長，菲律賓蛤仔的菌落總數呈上升趨勢，冷藏1 d后，菌落總數從最初的4.81 lg(CFU/g) 顯著增加至5.01 lg(CFU/g)(p<0.05)，這已超出了國際微生物標準委員會關于新鮮雙殼類軟體動物的微生物食用限量標準(105CFU/g)[21]。且冷藏3 d后菌落總數進一步增加至5.53 lg(CFU/g)(p<0.05)，說明腐敗程度加劇，潘瀾瀾等[22]發現，冷藏4 d后死亡的海灣扇貝的菌落總數有相似的結果5.6 lg (CFU/g)。伴隨著菌落總數的增加，感官評分則出現了明顯的降低，如圖1中所示，新鮮貝肉色澤相對明亮且肉質緊實，感官評分為9.2分，隨冷藏時間的延長，貝肉的光澤及彈性降低，冷藏3 d后感官評分已低至5.9分(p<0.05)，且有異味產生；冷藏4 d后樣本全部死亡，肉質泛白軟爛，失去彈性，異味重。這是由于，冷藏過程中微生物的生長代謝加速了營養物質的降解, 致使菲律賓蛤仔逐漸出現肉質松軟、色澤暗淡、散發腥臭味等腐敗現象, 感官品質均呈下降趨勢[23]。

2.1.2TVB-N的變化

揮發性鹽基氮(TVB-N)是樣品中的蛋白質在微生物和內源酶的作用下分解生成的氨類和胺等揮發性堿性含氮物質，是評價水產品新鮮度的重要指標，可以反映腐敗的程度。菲律賓蛤仔冷藏過程中TVB-N的變化如圖2所示。

圖2 菲律賓蛤仔冷藏過程中TVB-N的變化

通常情況下，TVB-N與微生物的生長有一定的相關性。從圖2可以看出，與圖1中菌落總數的變化類似，菲律賓蛤仔的TVB-N值隨冷藏時間的延長而增大，冷藏1 d后，其TVB-N值已顯著增大至12.23 mg/100 g，而冷藏3 d后則進一步增大至18.27 mg/100 g，超出了國內農業部關于海水貝類(NY/T 1329—2017綠色食品 海水貝)的限值(15 mg/100 g)，這也與圖1中感官評分的顯著降低相符，說明樣品已出現了明顯的腐敗變質。

2.2 腐敗菌株的分離鑒定

對菲律賓蛤仔冷藏過程中占比較大、形態顯著的菌落進行分離純化。最終根據菌落形態和顯微鏡檢結果將得到的菌株歸為7類，具體的菌株特征如表2所示。

表2 冷藏菲律賓蛤仔分離出的優勢菌株的特征比較

由表2可知， 除1號菌株為革蘭氏陽性球菌外，其余6株均為革蘭氏陰性桿菌。2號、3號、5號、6號、7號菌氧化酶試驗呈陽性，說明這幾株菌為不發酵的革蘭氏陰性桿菌。過氧化氫酶試驗中，僅4號菌株呈陰性，而其余菌株均呈陽性，說明這些菌株中均存在過氧化氫酶。進一步對7株細菌進行16S rRNA鑒定，將基因序列與NCBI中的基因總庫進行比對，選取其中最相似的序列進行相似性分析，結果如表3所示。

表3 各菌株的16S rRNA鑒定結果

從表3可以看出，7株菌的16S rDNA 序列與模式菌株序列的相似度均大于98%，再結合表2所得的形態顏色，生理生化結果，與表3各株細菌種類的形態特征基本吻合，說明鑒定結果可靠。1號、4號菌株為不動桿菌屬，2號菌株為希瓦氏菌屬，3號、6號及7號菌株為假單胞菌屬，而5號菌株為金黃桿菌屬，這與ODEYEMI O A等[24]的研究結果相似，他們從4 ℃冷藏貽貝中也主要分離得到了不動桿菌，希瓦氏菌及假單胞菌。將上述7株菌分別重新接種到新鮮菲律賓蛤仔樣品中，在4 ℃冷藏條件下，發現都加快了樣品的腐敗速度，冷藏菲律賓蛤仔提前出現色澤變暗，肉質軟爛以及腐臭異味等腐敗現象，也能說明分離出的7株菌是冷藏菲律賓蛤仔的腐敗菌。

2.3 不同因素對腐敗菌生長的影響

進一步分析7株腐敗菌在不同溫度、pH、NaCl及貝汁濃度下的生長特性。

2.3.1溫度

溫度對微生物的存活及生長有重要影響。7株腐敗菌在不同培養溫度下的生長狀況如圖3所示。

圖3 7株腐敗菌在不同溫度下的生長狀況

從圖3可以看出，培養溫度對7株腐敗菌的生長狀況有一定影響。整體來看，不動桿菌屬(1號及4號菌)生長情況相對較優，其次為可薩假單胞菌(3號菌)，而2號(腐敗希瓦氏菌)和5號(金黃桿菌)生長情況相似。1號、4號、5號菌在30 ℃生長最佳，其ΔOD600分別為0.76、0.84、0.55；3號、6號、7號菌在37 ℃生長最佳，其ΔOD600分別為0.67、0.55、0.54，而2號菌在25 ℃生長最佳，ΔOD600為0.54，顯著高于其他兩個溫度下的結果(p<0.05)，朱彥祺等[25]也發現分離自大黃魚的腐敗希瓦氏菌在25 ℃的延滯期顯著較短，而比生長速率較高。

2.3.2pH

7株腐敗菌在不同pH環境中的生長狀況如圖4所示。

圖4 7株腐敗菌在在不同pH環境中的生長狀況

2.3.3NaCl濃度

圖4表明，培養環境的pH條件會對7株腐敗菌的生長有一定的影響。除2號菌(腐敗希瓦氏菌)外，其余6株菌在pH=7的中性條件下生長良好。4號菌(溶血不動桿菌)的生長受環境pH的影響較小，其ΔOD600均相對較高。2號菌(腐敗希瓦氏菌)在pH=7～8時的生長量顯著高于pH=6時的結果，這與YOON J H等[26]對分離自海水中的希瓦氏菌的最適生長pH的結果相符。

NaCl濃度對7株腐敗菌生長狀況的影響如圖5所示。

圖5 7株腐敗菌在不同NaCl濃度下的生長狀況

從圖5可以看出，除2號菌外，添加1% 的NaCl有助于6株腐敗菌的生長，其ΔOD600顯著高于其他環境，但隨著NaCl濃度的升高，各菌的ΔOD600又相對降低，說明菌的生長受到一定的抑制。其中，在1%NaCl下，4號菌(溶血不動桿菌)與1號菌(威尼斯不動桿菌)的ΔOD600高達0.78與0.57，生長相對旺盛；而2號菌(腐敗希瓦氏菌)的ΔOD600僅為0.31，生長相對緩慢，這與趙二科等[27]研究中發現的希瓦氏菌的ΔOD600值(0.2～0.4)類似。

2.3.4貝汁濃度

表4給出了7株腐敗菌在不同貝汁濃度下的生長動力學參數信息。其中包括菌液樣本的初始濃度lg值(lgN0)、37 ℃下24 h后菌液樣本的末期濃度lg值(lgNmax)、生長延滯期Lag、最大比生長速率μmax以及對模型準確性的評價R2回歸系數(越接近1，模型擬合度越高)、MSE(均方誤差)。

表4 貝汁濃度對7株腐敗菌生長情況的影響

由表4可知，各模型的R2均大于0.93，且生長曲線都呈現出典型的“S”型特征，說明所采用的Baranyi and Roberts模型能準確描述7株腐敗菌在不同貝汁濃度下的生長規律。貝汁濃度對各菌株的延滯期影響較大，除6號菌外，其余菌株的延滯期在添加貝汁后菌有明顯的縮短，且與添加10%貝汁的結果相比，1號、2號、4號、5號、7號菌的延滯期在5%貝汁條件下更短，說明添加5%的貝汁可促進其生長繁殖，提高菌量。3號菌則在添加10%貝汁的條件下具有更短的延滯期。相比之下，添加貝汁對各菌株的比生長速率影響相對較小，說明貝汁環境不能加快各腐敗菌的生長速度。Baranyi and Roberts模型擬合結果說明延滯期與貯藏貝汁濃度有一定的線性關系[28]。

2.4 不同菌株腐敗能力的比較

將7株腐敗菌分別接種至滅菌貝汁并冷藏24 h和72 h后測得的菌落總數、TVB-N以及由其計算得到的腐敗代謝產物產量因子(YTVB-N/CFU)的結果如表5所示。

表5 分別接種7株菌后滅菌貝汁冷藏過程中的菌落總數，TVB-N及腐敗因子

從表5可以看出，接種2(腐敗希瓦氏菌)、3(可薩假單胞菌)、7(吲哚氧基假單胞菌)號菌株的貝汁并冷藏24 h后，其菌落總數顯著較高(p<0.05)，分別為4.01 lg(CFU/g)、3.98 lg(CFU/g)、3.89 lg(CFU/g)，且接種了2(腐敗希瓦氏菌)、3(可薩假單胞菌)號菌的貝汁的TVB-N值也顯著較高(p<0.05)，分別為2.03 mg/100 mL、1.96 mg/100 mL。而冷藏72 h后，接種1(威尼斯不動桿菌)、4(溶血不動桿菌)、5(金黃桿菌)、6(門多薩假單胞菌)號菌的貝汁的菌落總數顯著較高(p<0.05)，分別為6.29 lg(CFU/g)、6.26 lg(CFU/g)、6.13 lg(CFU/g)、6.24 lg(CFU/g)。但此時TVB-N值較高的樣本是接種了2(腐敗希瓦氏菌)、 3(可薩假單胞菌)和7(吲哚氧基假單胞菌)號菌的貝汁，分別為9.03 mg/100 mL、7.68 mg/100 mL和7.31 mg/100 mL。

Y(TVB-N/CFU)可以定量表征各腐敗菌的腐敗能力[9]。由表5可知， 2(腐敗希瓦氏菌)，3(可薩假單胞菌)及7(吲哚氧基假單胞菌)號菌的Y(TVB-N/CFU)值顯著高于其他腐敗菌(p<0.05)，其中， 2號及7號菌的Y(TVB-N/CFU)高達1.30×10-5mg/CFU，1.28×10-5mg/CFU，而3號菌的Y(TVB-N/CFU)也高達9.69×10-6mg/CFU。說明腐敗希瓦氏菌、吲哚氧基假單胞菌及可薩假單胞菌的致腐能力顯著較高，可以判定為冷藏菲律賓蛤仔中的優勢腐敗菌。這與郝若伊等[29]在4 ℃冷藏鮑魚中確定的優勢腐敗菌(腐敗希瓦氏和假單胞菌)相似。

3 結論

本研究在對冷藏菲律賓蛤仔的感官評分、菌落總數及揮發性鹽基氮變化規律研究的基礎上，采用傳統的培養方法對其中的腐敗菌進行分離和鑒定，研究了幾種因素(溫度、pH、鹽濃度及貝汁濃度)對腐敗菌生長特性的影響，最后通過比較腐敗能力確定了優勢腐敗菌。結果表明，菲律賓蛤仔冷藏過程中菌落總數及TVB-N顯著增大而感官評分相對減小。冷藏3 d后失去食用價值。分離純化后獲得7株腐敗菌，經過形態、生理生化及16S rRNA 序列分析后確定其分別歸屬不動桿菌(威尼斯不動桿菌；溶血不動桿菌)、假單胞菌(可薩假單胞菌；門多薩假單胞菌；吲哚氧基假單胞菌)、希瓦氏菌(腐敗希瓦氏菌)及金黃桿菌屬。不動桿菌屬的生長受溫度的影響較小，而腐敗希瓦氏菌在較低溫度(25 ℃)的生長相對較好；不動桿屬類受環境pH影響最小，腐敗希瓦氏菌在堿性環境中生長更好；除腐敗希瓦氏菌外，其余6株菌在中性及添加1% NaCl的環境中生長良好。添加5%的貝汁有助于縮短1、2、4、5、7號菌株的生長延滯期，促進其生長繁殖，但對比生長速率影響較小。腐敗希瓦氏菌、吲哚氧基假單胞菌、可薩假單胞菌的腐敗因子顯著較高，說明這3株菌為冷藏菲律賓蛤仔的優勢腐敗菌，且致腐能力：腐敗希瓦氏菌>吲哚氧基假單胞菌>可薩假單胞菌。該研究為后續靶向調控鮮活菲律賓蛤仔冷藏過程的品質劣變，延長貨架期可提供一定的參考。