得力勁酒中總黃酮的測定及其應用

周 爽， 王佳藝

上海冠生園華佗釀酒有限公司，上海 200040

《漢書·食貨志》中說 “酒，百藥之長”，中國古代為治療疾病在酒中加入藥材，制成藥酒。經過后世的發展,至今已分類為藥品批文的藥酒、有保健品批文的保健酒和含有一些藥食兩用的藥材的普通食品露酒。露酒以蒸餾酒、發酵酒或食用酒精為酒基,加入可食用或藥食兩用(或符合相關規定)的輔料或食品添加劑,進行調配、混合或再加工制成的,是一種已改變了其原酒基風格的飲料酒[1]。露酒的藥味沒有藥酒和保健酒濃烈，口感的愉悅度更好，更合適在多場景飲用。

生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一大類天然物質，廣泛存在于植物界，是許多中草藥中的有效成分。黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、強心、鎮靜和抗氧化、抗衰老、免疫調節和抗腫瘤等作用，具有很強的抗氧化和消除自由基作用。[2]

2022年6月1日實施的GB/T 17204《飲料酒術語和分類》中對露酒的定義為以黃酒、白酒為酒基，加入按照傳統即是食品又是中藥材或特定食品原輔料或符合相關規定的物質，經浸提和/或復蒸餾等工藝或直接加入從食品中提取的特定成分，制成的具有特定風格的飲料酒[3]，特別提到了中藥材，未來的露酒類產品會同時兼顧傳統的中醫藥和中國傳統的酒文化方向發展。深度地研究成分、口感也將是露酒質量控制的發展方向。中國勁酒、汾酒、瀘州老窖等酒企對旗下的露酒產品中的成分物質多有研究，如中國勁酒的毛鋪紫蕎酒就在外盒上標出總黃酮含量。

露酒所采用的一些藥食兩用的藥材一般都經過白酒的浸提。為了獲得更好的食用愉悅感，同時作為普通食品又沒有成分功能的要求，露酒中添加的藥材量相對藥酒和保健酒較少。本文參照《保健食品檢驗與評價技術規范》[4]和一些實用性文獻[2，5-6]，就露酒中總黃酮的含量情況做了一些研究。檢測樣品為上海冠生園華佗酒業有限公司生產的露酒——得力勁酒(含有枸杞，茯苓，山藥，甘草，大棗，桑椹，瑪咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香等藥材)。同時還對其浸提液中的總黃酮進行了測定。總黃酮的檢測方法經驗證后，初步設計了浸提工藝實驗，然后根據正交表對浸提液中的總黃酮進行了測定，得出最優浸提工藝。

1 儀器和材料

1.1 儀器與設備

UV-2600A型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 試劑

蘆丁標準品(批號：100080-201811)，中國藥品生物制品檢定所；甲醇，甲苯等均為分析純，聚酰胺粉(柱層析用，30目～60目)，國藥集團。

1.3 材料

得力勁酒第一次浸提液，得力勁酒第二次浸提液，成品得力勁酒。

樣品1批號：2022-001；樣品2批號：2022-002；樣品3 批號：2022-003。

浸提工藝實驗樣品的藥材：枸杞，茯苓，山藥，甘草，大棗，桑椹，瑪咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香。

浸提工藝實驗樣品的白酒酒基： 40%、50%、60%。

2 方法與結果

2.1 總黃酮檢測方法的確認

2.1.1蘆丁標準溶液的配制

稱取5.0 mg蘆丁，加甲醇溶解并定容至100 mL，即得50 μg/mL濃度的蘆丁標準溶液。

2.1.2最大波長的確定

取蘆丁標準溶液在200 nm～400 nm進行紫外波長掃描尋找最大吸收波長，見圖1，在360 nm波長處，蘆丁標準溶液的吸光度最高，因此選擇360 nm為最大測定波長。

圖1 蘆丁的紫外光譜圖

2.1.3標準曲線的制備

準確吸取50 μg/mL的蘆丁標準溶液：0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL于10 mL比色管中(含量相當于0 μg、5 μg、10 μg、15 μg、20 μg和25 μg)，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，以甲醇為空白，用1 cm比色皿于波長360 nm處測定吸光度A。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。求出回歸方程為y=0.029 2x+0.001 7，r=0.999 7。標準曲線見圖2。

圖2 聚酰胺—UV法標準曲線

2.1.4樣液制備及測定

試樣處理：準確吸取試樣1.00 mL于蒸發皿中，加1.00 g聚酰胺粉吸附，轉入10 mL層析柱。先用25 mL甲苯洗，甲苯液棄去，然后用甲醇洗脫黃酮，定容至25 mL。甲醇為空白，取待測樣液于1 cm比色皿中在波長360 nm處測定吸光度。依據標準曲線，計算試樣中總黃酮的含量[2]，見表1和表2。

表1 樣品的吸光度

表2 樣品總黃酮含量

2.1.5重復性試驗

準確吸取1 mL的樣品1第一次浸提液，測定其吸光度A，平行測定6次得到的試驗重復性，得出樣酒中總黃酮含量的標準偏差RSD為2.852%，見表3。

表3 重復性試驗結果(n=6)

2.1.6回收率試驗

取已測定含量的樣品2的第二次浸提液5 mL，其總黃酮含量為2.065 μg/mL, 準確吸取2 mL、3 mL、4 mL濃度為50 μg/mL的蘆丁標準溶液分別加入5 mL的浸提液中，加甲醇定容至10 mL，測定回收率。結果見表4。其平均回收率為102.23%，RSD=3.47%(n=6)。

表4 方法回收率試驗結果(n=6)

2.1.7穩定性試驗

選蘆丁標準溶液中的5 μg/mL，15 μg/mL，25 μg/mL作為1#，2#，3#及樣品(得力勁酒樣品1:2022-001中成品樣)測定吸光度后，放置10 min，20 min，30 min，40 min和60 min 后，分別測定其吸光度，由表5可看出，標準溶液及樣品在放置20 min，30 min和60 min后，其吸光度的值比較穩定。因此，當有較多樣品需要檢測時，不會因為放置時間較長而影響檢測的準確性。

表5 穩定性試驗結果

2.2 浸提工藝實驗

2.2.1正交實驗因素水平表

根據生產過程中浸提主要涉及三個因素，即浸提液酒精度、攪拌次數、浸提時間。本實驗采用正交試驗設計試驗方案，正交表為L9(33)，以總黃酮的含量作為指標進行正交實驗，因素水平表見表6。

表6 正交實驗因素水平表

2.2.2正交實驗結果

根據正交設計實驗方案，用藥材和40%、50%、60%的白酒進行2次、3次、4次和12 h、24 h、36 h的浸提實驗，測定其總黃酮數據，所得實驗結果及數據可見表7和表8。

表7 浸提實驗表

表8 極差結果分析

根據表8極差結果分析，C的極差R最大，其次是B，A。極差越大，該因素對總黃酮含量的影響程度越高。因此，在浸提過程中，以總黃酮含量為指標，3個因素對總黃酮含量的主次影響順序為：C>B>A，即浸提時間>攪拌次數>乙醇濃度。從各因素水平看(K值分析)，A因素為K3>K2>K1，B因素為K3>K2>K1，C因素為K3>K2>K1。由上述分析可以確定最佳浸提工藝條件為A3B3C3，即乙醇濃度為60%，攪拌次數為4次，浸提時間為36 h。

3 分析與結論

根據以上數據，使用聚酰胺UV法檢測得力勁酒及浸提液中的總黃酮含量，重復性、穩定性和準確性均符合要求。當然,得力勁酒中的總黃酮物質含量相對于藥酒和保健酒較低，但作為日常飲用可以少量補充總黃酮物質，對人體還是有益的。

從數據中還可以看出，第一次浸提液含有較多總黃酮，第二次浸提液總黃酮含量減少，這是由于浸提中使用的白酒體積約占成品體積的20%，說明第一次浸提基本將大部分總黃酮提取出來了，但第二次浸提也是有一定貢獻的。最后的工藝決定了成品的總黃酮含量較第一次浸提液也有所減少。

以總黃酮含量作為參考值，開展正交試驗對浸提時間、攪拌次數、浸提液濃度三因素進行分析后，發現浸提時間對總黃酮的提取影響最大，同時高濃度提取液對總黃酮的提取優于低濃度，攪拌次數的增加有利于總黃酮的提取。

4 討論

露酒工藝中的浸提工序是確保浸提物質質量的關鍵。露酒國標GB/T 27588—2011中對成品有干浸出物的要求，得力勁酒屬于動植物類露酒，干浸出物(g/L)≥0.5，對該酒的多年質量跟蹤完全可以滿足這一要求，但干浸出物無法作為成分指標的依據。本文采用保健食品中總黃酮含量的測定方法——直接紫外法對露酒得力勁酒中的總黃酮的含量進行了測定，并對該方法在得力勁酒中總黃酮的測定的重復性和穩定性進行了驗證。

通過對得力勁酒中總黃酮的測定，初步考察了目前該酒的成分情況，為以后深度開發升級產品提供了指標依據。就目前而言，對現有的浸提工藝方法可以進行再組合優化，從時間、浸提酒基、攪拌次數等多方面出發，將總黃酮指標作為參照指標，更科學的為浸提有效成分做合理的工藝設計。同時，為控制產品的穩定性，也可以通過對總黃酮含量的測定，控制浸提過程的質量，以提升和穩定產品的品質。

對總黃酮的測定還有比色法等其他方法，對樣品的前處理也有超聲波等不同的幾種方法，由于中藥材本身所含的物質比較復雜，醇提法對中藥材里面多數物質都具有較好的提取效果，但是傳統的發酵白酒也是含有比較復雜物質成分，因此后面還可以應用不同的方法對得力勁酒中的總黃酮進行測定，不同方法的提取處理和最終數值的差異情況進行比對和分析，從而確定最適合該類露酒的總黃酮測定方法。