異芒果苷通過調節PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路抑制惡性膠質瘤的惡性行為*

唐春花，寧志豐，周雄飛，毛開新，胡美純，吳 喆，王 龍，蘇延停，劉星吟

（1.湖北科技學院附屬第二醫院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院基礎醫學院，湖北 咸寧 437100；3.湖北科技學院國家級全科醫學實驗教學示范中心，湖北 咸寧 437100）

神經膠質瘤亦稱膠質細胞瘤，簡稱膠質瘤，是發生于神經外胚層的腫瘤，亦稱神經外胚層腫瘤或神經上皮腫瘤。腫瘤起源于神經間質細胞，即神經膠質、室管膜、脈絡叢上皮和神經實質細胞，即神經元。大多數腫瘤起源于不同類型的神經膠質，但根據組織發生學來源及生物學特征類似，對發生于神經外胚層的各種腫瘤，一般都稱為神經膠質瘤。據統計在美國，癌癥的發病率為21%，其中神經系統腫瘤占常見兒童癌癥的27%[1]比2020統計數據增加1%[1-2]，目前膠質瘤治療以手術切除輔以放化療為主，但療效不理想。盡管膠質瘤的治療方案不斷優化，但大多數惡性膠質瘤患者的2年預后仍然很差[3]。近年來隨著對中藥活性成分的分離鑒定等研究，也發現越來越多具有抗腫瘤活性的活性成分如芒果苷[4]和異芒果苷[5]。異芒果苷是鳶尾科植物的主要活性成分，尚未見關于異芒果苷抑制惡性膠質瘤的報道。本文旨在研究異芒果苷對惡性膠質瘤的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 惡性膠質瘤U251和人腦正常膠質細胞株HEB購于武漢大學中國培養物典藏中心，DMEM高糖培養基、胎牛血清選自Hyclone公司，異芒果苷來源于上海源葉，MTT和Hoechst細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，實驗所用抗體全部來自ABclonal。

1.2 細胞培養 按常規方法用含10%胎牛血清和100×青霉素及/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基，在37℃、5% CO2及100%濕度的培養箱中培養，根據細胞的生長狀況每2～3 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT實驗 取對數生長期的U251細胞，調整細胞濃度8×104個/mL后，以每孔100 μL即8 000個細胞接種至96孔板，并使每個孔的細胞均勻分布后，將其放入細胞培養箱中培養5 h待細胞貼壁后，用異芒果苷處理細胞，異芒果苷的給藥濃度為0、1、2、4、8、16 μM，每個濃度4個復孔，給藥濃度為0的一組為對照組，培養48h，選取4 μM作為給藥時間考察的濃度，分別培養24、72、96 h，實驗終止時，使用MTT法檢測每孔的吸光值（A值），計算腫瘤細胞生長率=（A給藥組-A空白對照組）/A對照組×100%。

1.4 平板克隆形成實驗 取對數生長期的U251細胞，調整細胞濃度1 000個/mL，以每孔1 mL即1 000個細胞接種至6孔板，并使每個孔的細胞均勻分布后，將其放入細胞培養箱培養24 h待每個低倍鏡顯微鏡（20×）下能觀察到生長良好的單個細胞后，用異芒果苷處理細胞，異芒果苷的給藥濃度為0、1、2、4、8、16 μM，給藥濃度為 0的 1組為對照組。3 d左右換1次細胞培養液，隨后在細胞培養箱中靜置培養1周時間后終止培養（以對照組生成均勻的肉眼可見的細胞群落為止）。然后用PBS浸洗3遍6孔板中的細胞，接著用預冷的甲醇室溫固定細胞20 min，后用0.1%結晶紫染液對細胞染色20 min并用清水沖洗掉多余結晶紫染色液，最后在顯微鏡下觀察并計數含50個以上細胞的克隆數目。然后按公式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 Transwell小室遷移和侵襲實驗 用DMEM高糖無血清培養基按照1∶3稀釋matrigel膠包被上室，每孔70 μL，室溫孵育4 h。取對數生長期的U251細胞，用無血清培養基重懸細胞后，調整細胞濃度為2×106個/mL，以每孔 100 μL 即 2×105個細胞接種至接種于上室即Transwell小室內。下室即24孔板中加入500 μL含20%FBS和不同濃度的異芒果苷的完全培養基，其中20%FBS作為趨化劑，異芒果苷的給藥濃度為0、4、16 μM培養24 h左右，其中給藥濃度為0的1組為對照組，培養結束后，去除培養液，用棉簽擦去上室的細胞，然后用預凍甲醇固定細胞20 min，隨后用PBS清洗細胞3遍，接著用0.1%結晶紫染液對細胞染色20 min并用清水沖洗掉多余結晶紫染色液，室溫靜置24 h使Transwell小室和細胞干燥，后在顯微鏡下計數移至微孔膜下層的細胞，每個樣本計數5個視野。遷移實驗與細胞侵襲實驗相同，但不需要在上室包被matrigel膠。

1.6 細胞劃痕實驗 取對數生長期的U251細胞，調整細胞濃度25×104個/mL，以每孔1 mL即25萬個細胞接種至6孔板，并使每個孔的細胞均勻分布后，將其放入細胞培養箱培養48 h待每個孔的細胞愈合率達到90%～100%時，用1 mL的槍頭在每孔中間劃一道豎線，去掉線上的細胞即可，不要劃傷六孔板底部的包被膜。隨后用PBS沖洗掉脫落的細胞。最后用異芒果苷處理細胞，異芒果苷的給藥濃度為0、4和16 μM每個濃度2個復孔，給藥濃度為0的1組為對照組。并在給藥培養12 h和24 h時顯微鏡下觀察并記錄劃痕的愈合情況。

1.7 細胞凋亡實驗 取對數生長期的U251細胞，調整細胞濃度6.5×104個/mL后，以每孔100 μL即6 500個細胞接種至96孔板，并使每個孔的細胞均勻分布后，將其放入細胞培養箱培養5 h待細胞貼壁后，用異芒果苷處理細胞，異芒果苷的給藥濃度為0、4、16 μM，每個濃度3個復孔，其中給藥濃度為0的1組為對照組，培養48 h后，使用Hoechst細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡情況，染色后將不同給藥濃度的細胞在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.8 Western blot實驗 取對數生長期的U251細胞，調整細胞濃度3.4×106個/mL后，以每培養皿1 mL即340萬個細胞接種至培養皿，并使每個培養皿的細胞均勻分布后，將其放入細胞培養箱培養5 h待細胞貼壁后，用異芒果苷處理細胞，異芒果苷的給藥濃度為0、4、16 μM，其中給藥濃度為0的1組為對照組。培養48 h后，用RIPA細胞裂解液提取每個培養皿的細胞的總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，取等量蛋白上樣，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，以GAPDH作為內參、PTEN、總PI3K、總 AKT、mTOR、磷酸化的 PI3K、磷酸化的 AKt和磷酸化的mTOR作為一抗，恒壓100 v電泳。以400 mA電流轉膜45 min后，用5%BSA進行室溫封閉1 h，一抗稀釋液孵育PVDF膜4℃過夜。1×TBST洗膜3次，二抗稀釋液室溫孵育1 h，顯色曝光獲得條帶灰度值，并進行統計學分析。

1.9 RNA干擾 利用siRNA在線設計工具siDirect 2.0設計3對針對PTEN3’-UTR區的小干擾RNA，siRNA序列如表1。利用Lipofectamine 2000將siRNA和siRNA-control轉染HEB細胞，western blot檢測沉默效果，以沉默效率達85%以上的siRNA進行下一步實驗。

表1 siRNA序列

1.10 統計學方法 應用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析處理，隨后用GraphPad 5進行統計圖繪制。運用t檢驗或單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05判斷為差異有統計學意義，所有實驗重復3次。

2 實驗結果

2.1 異芒果苷抑制U251細胞的增殖 根據MTT的實驗結果，計算出異芒果苷對U251的IC50為（4.4±0.25）μM，且隨著異芒果苷的濃度增加，U251細胞的抑制率隨之升高，呈濃度依賴性（見圖1A），通過考察給藥 24、48、72、96 h，4 μM 異芒果苷對 U251 的抑制作用，發現與對照組相比，異芒果苷給藥24 h，兩者的U251細胞生存率無明顯差異，但給藥48 h兩者出現統計學差異（P＜0.05），并隨著給藥時間的延長兩者的差異越來越顯著，表明異芒果苷對U251的抑制作用呈顯著的時間依賴性（見圖1B）。且隨著藥物濃度增加，細胞逐漸變圓（見圖1C）。由此可知異芒果苷對惡性膠質瘤細胞U251的抑制效果隨著異芒果苷的給藥濃度增加和給藥時間的延長而增加；即異芒果苷對U251的抑制作用呈濃度和時間依賴性，根據MTT實驗結果，transwell遷移和侵襲實驗以及細胞劃痕實驗的給藥濃度和時間分別定為0、4、16 μm和24 h（劃痕試驗增加1個12 h）；western blot實驗和凋亡實驗的給藥濃度和時間分別定為0、4、16 μm和48 h。

圖1 異芒果苷抑制U251細胞的存活和增殖

2.2 異芒果苷抑制U251細胞的平板克隆形成能力根據平板克隆形成實驗結果，1 μM異芒果苷就可以初步抑制U251細胞的克隆形成，4 μM異芒果苷就可以抑制50%左右的U251細胞的克隆形成，16 μM異芒果苷處理后U251只能形成20%的克隆群落。故異芒果苷能有效抑制惡性膠質瘤U251細胞的克隆形成，并隨著異芒果苷的濃度增加呈現濃度依賴性。（見圖2）

圖2 異芒果苷抑制U251細胞的克隆形成

2.3 異芒果苷抑制U251細胞的遷移和侵襲能力根據Transwell小室遷移、侵襲實驗結果可知，當異芒果苷的給藥濃度為4 μM時，就可以顯著抑制U251細胞的縱向遷移和侵襲，16 μM異芒果苷就可以顯著抑制50%左右的U251細胞的縱向遷移和侵襲；通過細胞劃痕實驗可知，當異芒果苷的給藥濃度為4 μM，給藥時間為12 h時與未給藥組比，劃痕愈合率就有統計學差異（P＜0.05），隨著給藥濃度和時間的增加劃痕愈合率顯著降低，表明異芒果苷對U251細胞的橫向遷移的抑制呈濃度和時間依賴性。由此可知異芒果苷可以抑制惡性膠質瘤U251細胞的縱向遷移和侵襲能力以及橫向遷移能力，且呈濃度和時間依賴性（見圖3）。

圖3 異芒果苷抑制U251細胞的遷移和侵襲

2.4 異芒果苷通過下調PTEN-PI3K-AKt-mTOR抑制U251細胞 通過Western blot實驗，我們發現異芒果苷可以濃度依賴性的上調PTEN的表達，進而抑制磷酸化的PI3K、磷酸化的AKt及磷酸化的mTOR的表達量，而不影響總PI3K、總AKt及總mTOR的表達量（見圖4A）。我們設計了3對針對PTEN 3’-UTR區的siRNA，發現siRNA-2沉默效率最好，可達85%以上，故選取siRNA-3開展后續實驗（見圖4B），siRNA沉默PTEN可以部分抵消異芒果苷對U251細胞的抑制作用（見圖4C）。故異芒果苷可以通過調控PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路對惡性膠質瘤U251產生抑制作用。

圖4 異芒果苷通過調控PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路抑制U251

3 討論

由實驗結果可知異芒果苷可以抑制U251細胞的增殖、遷移和侵襲、單克隆形成，經過初步探索其作用機制，我們發現異芒果苷可以誘導U251細胞的凋亡，進而發現其可以通過調控PTEN-PI3K-AKtmTOR通路從而對惡性膠質瘤U251細胞產生抑制作用。并得出結論，異芒果苷可以抑制惡性膠質瘤U251細胞的惡性生物學行為，且作用機制與直接或間接調控PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路有關。

異芒果苷是鳶尾科植物的主要活性成分，屬于C-葡萄糖苷氧雜蒽酮類化合物[5]。有研究表明其可以作為一種新型強效的血管內皮生長因子受體2激酶抑制劑來抑制乳腺癌的增殖、轉移和血管生成[6]。除此之外異芒果苷還可以靶向HMGB1/NLRP3/NF-κB通路來抑制炎癥反應[7]。雖然已有報道說明異芒果苷的確有抗腫瘤作用，但其的抗腫瘤譜和具體的作用機制還需進一步研究。而PTEN基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN），又稱為 MMAC1（mutated in multiple advanced cancer 1）和 TEP1（TGF-regulated and epithelial cell-enriched phosphatase）。定位于染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質，具有磷酸酯酶的活性[8]。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發生發展[9-10]。

有研究發現，在中樞神經腫瘤特別是膠質瘤中普遍存在PTEN基因的突變或缺失[8，11-12]。而PTEN基因的表達可通過特異性地使IP3的第3位磷酸去磷酸化而間接地抑制胰島素誘導的磷酸肌醇-3激酶（PI3K）的活性，而PI3K是其下游信號通路的主要二級信使，故PI3K的下游信號也因此誘導抑制，包括膜募集和絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的激活[13]。而PI3K、AKt和mTOR信號通路，在生理和病理條件下對細胞的生長和生存至關重要，其相互間聯系緊密，故在一定程度上可以視為一個單獨的、特殊的通路[14]，其中PI3K/Akt通路是細胞應激過程中存活的關鍵調節因子[15]，如促進腫瘤細胞的增殖、存活、遷移/侵襲以及上皮間質轉變（EMT）、抑制凋亡、自噬和衰老等[16]，并對正常組織和腫瘤組織中的血管生成起到重要作用[17-18]。

本實驗中我們通過細胞活性實驗—MTT實驗、克隆形成試驗—平板克隆形成實驗、遷移和侵襲試驗—transwell遷移和侵襲試驗以及劃痕實驗證明異芒果苷可以抑制惡性膠質瘤細胞U251的增殖、克隆形成、遷移和侵襲。通過western blot實驗，我們進一步發現異芒果苷可以通過PTEN-PI3K-AKt-mTOR通路發揮抗腫瘤作用。雖然實驗中還有一些不足之處，如異芒果苷對PTEN下游的其它通路的作用未進行探索，也未進一步研究異芒果苷對PTEN靶點是直接作用還是間接作用，即未對異芒果苷與PTEN的作用位點或原理進行研究，再者也未開展動物實驗對異芒果苷的藥效進行進一步確認。但本次實驗拓展了異芒果苷的抗腫瘤譜，并提供了其抗腫瘤的一種可能的作用機制，為異芒果苷的未來臨床應用或結構改造提供數據支持。