紅外光譜數(shù)據(jù)融合對(duì)栽培滇重樓產(chǎn)地鑒別*

丁于剛，張慶芝

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

作為百合科多年生草本植物，滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）的根莖被廣泛應(yīng)用于中國(guó)、印度、不丹、尼泊爾等國(guó)家[1]。重樓在中國(guó)有超過(guò)兩千年的藥用歷史，最早被名為“蚤休”記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》中[2]并記其“味苦微寒，主驚癇搖頭弄舌，熱氣在腹中，癲疾，癰瘡陰蝕，下三蟲，去蛇毒”，現(xiàn)代藥理研究表明重樓具有抗腫瘤、凝血、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗微生物活性等[1]藥理活性。中國(guó)是重樓最大的生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，在過(guò)去的40年間，重樓藥材的市場(chǎng)價(jià)從2.7元/kg增漲到了600～750元/kg[3]。隨著市場(chǎng)需求的增大，野生重樓藥材已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)的需要。多樣的環(huán)境因素使得不同產(chǎn)地的栽培滇重樓化學(xué)成分也各有不同，且影響滇重樓的分布的主導(dǎo)因子與其地理環(huán)境息息相關(guān)[4]。因此，藥材的產(chǎn)地溯源對(duì)其質(zhì)量控制及合理開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。滇重樓化學(xué)成分的差異主要體現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物甾體皂苷類化合物上，有研究表明不同產(chǎn)地、不同年份的滇重樓其化學(xué)成分具有較大的差異[5-6]。裴藝菲等采用多光譜技術(shù)對(duì)云南不同產(chǎn)地滇重樓進(jìn)行了分析，結(jié)果表明單一光譜建立的模型正確率較高[7]。目前為止，不同類型的檢測(cè)分析技術(shù)被成功應(yīng)用于鑒別滇重樓的來(lái)源，例如高效液相色譜法（HPLC，High performance liquid chromatography）[8-9]、超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLCMS/MS，Ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry）等[6]。然而，這些技術(shù)需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理、有害試劑的使用、對(duì)實(shí)驗(yàn)員的高要求等，基于濕法的液相色譜法的方法不適于大量樣本的快簡(jiǎn)分析。振動(dòng)光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)已然成為一種綠色、快捷的方法，這使得利用紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地的栽培滇重樓的快速鑒別成為了可能。中級(jí)數(shù)據(jù)融合能減少大量的冗余和無(wú)關(guān)變量，在模式識(shí)別分析中更具有可靠性。通過(guò)采集云南和四川共8個(gè)產(chǎn)地的滇重樓根莖的近紅外和中紅外光譜數(shù)據(jù)，光譜數(shù)據(jù)表征不同產(chǎn)地植物樣品的化學(xué)信息差異。結(jié)合多元變量提取方法，建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的產(chǎn)地模式識(shí)別方法，以促進(jìn)云南不同產(chǎn)地栽培滇重樓的合理開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究實(shí)驗(yàn)樣品為栽培滇重樓的干燥根莖樣品，原植物采自我國(guó)西南的云南和四川省，包括保山、楚雄、大理、紅河、麗江、文山、玉溪和成都。所有采集原植物均經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)張慶芝教授鑒定為滇重樓（P.polyphylla var.yunnanensis）。所有樣品信息如表1所示，樣品采集后經(jīng)清洗干凈后切片，在50℃下烘干。后經(jīng)打粉機(jī)粉碎后過(guò)100目篩，所有樣品均置于干燥皿中待下一步分析。

表1 重樓樣品信息表

1.2 紅外光譜采集

1.2.1 衰減全反射傅里葉變換中紅外光譜 衰減全反射傅里葉變換中紅外光譜采集自配備氘化三甘氨酸硫酸鹽（DTGS）檢測(cè)器和ZnSe衰減全反射元件的中紅外光譜儀。光譜采集范圍為4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品累積掃描16次。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)掃描后，得到了所有樣品的光譜數(shù)據(jù)。光譜采集室恒定的溫度和濕度由溫濕度控制儀進(jìn)行調(diào)控，所有采集得到的光譜數(shù)據(jù)由SIMCA-P+14.1進(jìn)行分析。

1.2.2 傅里葉變換近紅外光譜 重樓樣品的近紅外光譜由AntarisⅡ型光譜儀檢測(cè)，儀器結(jié)合漫反射附件。光譜采集波數(shù)范圍為10 000～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。樣品采集室的溫度和濕度維持恒定的值，溫度（25℃，30%RH）。每次采集樣品光譜之前，空氣背景（CO2和H2O）會(huì)被校正以減小誤差。每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次，3次后的平均光譜將用于進(jìn)行下一步分析。

1.2.3 紅外光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理 從光譜檢測(cè)儀獲得的原始數(shù)據(jù)往往會(huì)包含一些干擾信息，它們來(lái)自環(huán)境因素、檢測(cè)器和其它因素等[10-11]。在本研究中，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV，standard normal variate transformation）[12]以減少由樣品物理狀態(tài)帶來(lái)的散射干擾，同時(shí)可以將變量平衡在0～1之間。

1.3 模式識(shí)別技術(shù) 在最初，偏最小二乘算法（PLS，partial least squares algorithm）被應(yīng)用于回歸問(wèn)題的處理。在偏最小二乘回歸中，變量矩陣Y（Y block）與訓(xùn)練集X（X block）按照常規(guī)方法配對(duì)[13]。一般來(lái)說(shuō)，偏最小二乘判別分析（PLS-DA）應(yīng)用于特定情況如Y是類別數(shù)據(jù)。偏最小二乘判別模型的建立主要分為4步：數(shù)據(jù)預(yù)處理、降維、模型驗(yàn)證和決策。本研究運(yùn)用了7折交叉外部驗(yàn)證，R2（Coefficient of determination of model fitting）、Q2（Prediction）、RMSEE（Root mean squared error of estimation）、RMSEP （Root mean squared error of prediction）、RMSECV （Root mean squared error of calibration validation）等參數(shù)被用來(lái)評(píng)價(jià)模型的優(yōu)劣。一般來(lái)說(shuō)，Q2大于0.5表明模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，而模型的穩(wěn)定性則與R2有關(guān)。所有數(shù)據(jù)處理和建模均在SIMCA-P+14.1軟件完成。

1.4 特征變量提取 變量投影重要性（VIP，Variable importance for the projection）是衡量PLS-DA模型中單個(gè)變量對(duì)整個(gè)模型的影響的參數(shù)。VIP值為數(shù)值的均方根，一般來(lái)說(shuō)，它代表了相關(guān)性[14]。選取VIP值大于1的變量建立模型能減少其他不重要變量帶來(lái)的干擾，從而提高分類效果。SPA的優(yōu)勢(shì)是能夠消除大量的冗余信息，適合于光譜特征波長(zhǎng)的篩選，并已被證實(shí)結(jié)合分類算法（如SPA-PLS-DA）具有較好的效果[15-16]。競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)再加權(quán)算法（CARS，Competitive adaptive reweighted sampling），有別于其他的特征變量篩選方法，主要通過(guò)自適應(yīng)再加權(quán)采樣技術(shù)選擇出偏最小二乘回歸系數(shù)絕對(duì)值較大的波長(zhǎng)點(diǎn)，根據(jù)交叉驗(yàn)證選出RMSECV值最小的子集[17]。序列正交協(xié)方差特征變量選擇（SO-CovSel，sequential and orthogonalized covariance selection），通過(guò)對(duì)每個(gè)預(yù)測(cè)變量與所有變量之間的協(xié)方差進(jìn)行評(píng)估，篩選出協(xié)方差最高的變量作為特征變量[18]。基于以上原理，所有的預(yù)測(cè)因子和相應(yīng)的響應(yīng)值將會(huì)被統(tǒng)計(jì)，并將重復(fù)以上過(guò)程，直至選擇出適當(dāng)?shù)淖兞繑?shù)。

光譜數(shù)據(jù)具有復(fù)雜、多維的特點(diǎn)，本研究采用多種不同的特征變量提取方法旨在從不同的角度簡(jiǎn)化和提高模型的可解釋性。

1.5 多源數(shù)據(jù)融合策略 當(dāng)處理來(lái)自多傳感器的數(shù)據(jù)時(shí)，多源數(shù)據(jù)融合策略（MSDF，Multi-sensor data fusion）是比較適用的方法。數(shù)據(jù)融合策略通過(guò)結(jié)合不同模塊的數(shù)據(jù)，進(jìn)而分析可以得到相比單一來(lái)源數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確和有效的決策[19]。總的來(lái)說(shuō)，根據(jù)融合策略的不同，數(shù)據(jù)融合方法可分為數(shù)據(jù)級(jí)融合（Low level）、特征級(jí)融合（Mid-level）和決策級(jí)融合（Decision-level）。在本文中采用了2種數(shù)據(jù)融合策略進(jìn)行對(duì)比，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜的特征解釋 根莖樣品的傅里葉變換中紅外光譜圖能夠反映化學(xué)信息，體現(xiàn)不同產(chǎn)地滇重樓的差異。在本研究中，來(lái)自8個(gè)產(chǎn)地的滇重樓中紅外和近紅外光譜數(shù)據(jù)均做了平均處理。如圖1所示，經(jīng)過(guò)二階導(dǎo)數(shù)的光譜相比于原始光譜更能反映出樣品的化學(xué)信息[20]。在二階導(dǎo)數(shù)的光譜中，共有20個(gè)顯著的吸收峰（2 927，2 852，1 745，1 459，1 415，1 372，1 336，1 240，1 204，1 154，1 106，1 079，1 049，1 020，995，925，896，863，767，711 cm-1）[21]。其中，3 334 cm-1的峰為羥基的伸縮振動(dòng)吸收，2 927、2 852、1 459、1 415 和 1 312 cm-1的吸收主要為來(lái)自亞甲基碳?xì)滏I的彎曲和伸縮振動(dòng)。在1 745 cm-1的較大吸收峰為碳氧雙鍵的伸縮振動(dòng)，推測(cè)與甾體皂苷、黃酮、揮發(fā)油及多糖類物質(zhì)相關(guān)[22]。1 300～400 cm-1范圍的峰較為密集且復(fù)雜，為樣品的指紋圖譜區(qū)。

圖1 保山、楚雄、大理、紅河、麗江、成都、玉溪、文山的ATR-FTMIR和FT-NIR

相較于中紅外光譜，來(lái)自8個(gè)地區(qū)的平均近紅外光譜吸收峰較少。5 500 cm～4 200-1光譜區(qū)域?yàn)槠渲饕詹ǘ危摬ǘ蔚奈湛赡芘c碳?xì)滏I的變形和氧氫、氮?dú)洹⑻細(xì)浣M合模式的第二泛音有關(guān)[23]。位于7 200～5 500 cm-1的低頻區(qū)的2個(gè)吸收峰歸屬于碳?xì)洹⒀鯕浜偷獨(dú)滏I伸縮振動(dòng)的泛音，而碳?xì)洹⒀鯕浜偷獨(dú)滏I伸縮振動(dòng)的第二泛音則位于9 000～7 500 cm-1的弱吸收峰處[24]。整體上看，不同產(chǎn)地的中紅外和近紅外光譜吸收峰位置相同，但是強(qiáng)度略有差異，僅憑平均光譜圖的差異難以實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地滇重樓的鑒別。

2.2 多源數(shù)據(jù)融合策略結(jié)合PLS-DA判別滇重樓產(chǎn)地

2.2.1 基于低級(jí)數(shù)據(jù)融合的PLS-DA 在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)SIMCA-P+14.1對(duì)采集自樣品的中紅外和近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，共得到3 346個(gè)變量（FTNIR：1 557個(gè)變量，ATR-FTMIR：1 789個(gè)變量）。在進(jìn)行建模之前，先對(duì)所有來(lái)自8個(gè)大類的樣品進(jìn)行KS訓(xùn)練，將樣品分為2/3的訓(xùn)練集和1/3的預(yù)測(cè)集。在對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行SNV預(yù)處理之后，中紅外和近紅外的數(shù)據(jù)被串聯(lián)建立PLS-DA模型。PLS-DA模型的最佳潛在變量數(shù)則是根據(jù)模型的交叉驗(yàn)證均方根誤差和Q2決定的，如圖2所示所有模型的最佳潛在變量數(shù)均已確定。模型參數(shù)如表2所示，訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的正確率均達(dá)到了100%。

圖2 PLS-DA模型的最佳潛在變量數(shù)

表2 基于數(shù)據(jù)融合的多種PLS-DA模型的參數(shù)值

2.2.2 中級(jí)數(shù)據(jù)融合結(jié)合PLS-DA 區(qū)別于低級(jí)數(shù)據(jù)融合較為龐大的計(jì)算量，特征級(jí)融合摒除了大量的冗余變量從而使模型較為簡(jiǎn)單[25]。基于VIP的特征變量選擇方法分別從中紅外和近紅外數(shù)據(jù)中篩選出VIP值大于1的變量，這505和500個(gè)變量將被視為重要變量進(jìn)行下一步分析[26-27]。根據(jù)VIP-PLS-DA模型可知，最佳潛在變量數(shù)為19，訓(xùn)練集正確率達(dá)到100%，訓(xùn)練集正確率達(dá)到99.60%，只有預(yù)測(cè)集中有2個(gè)樣品被錯(cuò)誤分類。

基于SPA選擇的特征變量來(lái)自光譜的各個(gè)波段。來(lái)自不同傳感器的特征變量組成一個(gè)新的366×132的數(shù)據(jù)集，根據(jù)模型可知，其最佳LVs為15，模型預(yù)測(cè)集正確率為94.02%。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)再加權(quán)算法的原理可知，在交叉驗(yàn)證均方根誤差最低時(shí)篩選的變量為最佳變量數(shù)。隨著模型運(yùn)行次數(shù)的增加，交叉驗(yàn)證均方根誤差呈高-低-高的變化趨勢(shì)，無(wú)關(guān)冗余變量被剔除，均方根誤差減小，在最佳變量數(shù)時(shí)達(dá)到最低值。但隨著采樣的繼續(xù)進(jìn)行，RMSECV增加是因?yàn)橄吮匾淖兞俊Ｗ罱K共有32和76個(gè)變量參與模型的建立。采用SO-CovSel特征變量篩選方法篩選的變量數(shù)較少，分別為（10×366）和（4×366）變量并進(jìn)行下一步建模分析。結(jié)果表明，基于低級(jí)數(shù)據(jù)融合的效果最佳，訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集正率均達(dá)到了100%。而基于SO-CovSel方法的模型效果最差，預(yù)測(cè)集正確率僅有84.62%。

3 討論

從8個(gè)產(chǎn)地的滇重樓平均中紅外光譜圖可以得出，來(lái)自四川成都的樣品在3 000～2 800 cm-1與其它產(chǎn)地具有較為明顯的差異，這可能是四川盆地相對(duì)獨(dú)特的氣候條件所致。Yang等通過(guò)超高效液相色譜-紫外串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-UV-MS，Ultra-performance liquid chromatography-ultraviolet spectroscopy-tan－dem mass spectrometry）檢測(cè)了不同產(chǎn)地滇重樓的皂苷類成分含量，結(jié)果顯示云南省南部地區(qū)總皂苷的平均值顯著高于中部地區(qū)[6]。表明不同產(chǎn)地的滇重樓，其有效成分的差異較為明顯。

根據(jù)模型正確率和參數(shù)表明（表2），基于低級(jí)數(shù)據(jù)融合建立的偏最小二乘判別分析模型效果最優(yōu)，低級(jí)數(shù)據(jù)融合通過(guò)串聯(lián)不同傳感器的信息能最大限度的保留樣品的化學(xué)信息。在中級(jí)數(shù)據(jù)融合中，最終變量數(shù)較多的模型其參數(shù)較優(yōu)，正確率較高。這可能是因?yàn)樵谌コ罅咳哂嘈畔⒌耐瑫r(shí)，許多對(duì)建立模型有效的變量也被去除。令人意外的是，基于SPA變量選擇方法的模型效果達(dá)到了94.02%，因其只在較少的變量上進(jìn)行分析，表明該方法具有較好的泛化能力。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)紅外光譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)融合方法，采用PLS-DA模型對(duì)來(lái)自四川和云南8個(gè)產(chǎn)區(qū)的栽培滇重樓進(jìn)行了鑒別分析。在特征級(jí)數(shù)據(jù)融合中采用了多種特征變量提取方法，結(jié)果表明基于VIP特征變量提取方法模型結(jié)果較優(yōu)，其正確率達(dá)到99.60%，預(yù)測(cè)集中只有2個(gè)樣品被錯(cuò)誤分類。綜合兩種數(shù)據(jù)融合類型，初級(jí)數(shù)據(jù)融合的模型效果最優(yōu)，分類正確率達(dá)到了100%。綜合模型可知不同傳感器來(lái)源的數(shù)據(jù)具有協(xié)同性，該方法能夠成功應(yīng)用于不同產(chǎn)地滇重樓的鑒別。