UPLC-MS/MS檢測女金丸中9種青霉素類抗生素殘留*

李應才，黃合琤，董麗榮，楊 野

(1.昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032；2.昆明理工大學，云南 昆明 650500)

女金丸（水蜜丸）是由當歸等23味中藥，粉碎成細粉，過篩，混均，每100 g粉末用煉蜜35～50 g作為黏合劑，加適量水制成的固體制劑[1]。在蜜蜂養殖中，蜂農為了防病治病，會使用氯霉素、青霉素等各種抗生素，從而殘留在蜂蜜中[2-5]。青霉素類抗生素具有較多的不良反應，包括過敏反應、皮疹、白細胞數目減少、心率增加、惡心、嘔吐、血尿等，會累及多個系統及器官，使患者的器官功能受到損害，更有甚者會威脅生命安全[6-7]。目前有文獻報道蜂蜜中抗生素的檢測[8-11]，但中藥丸劑中抗生素的檢測少有報道。中藥丸劑的制備，如果使用了抗生素殘留超標的蜂蜜，將帶入制劑中，對人體產生傷害。本試驗以女金丸（水蜜丸）為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯質譜法[12-24]，建立了一種快速、有效檢測女金丸中9種青霉素類抗生素殘留的檢測方法，為中藥丸劑中抗生素殘留的檢驗研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AB SCIE 5500+QTRAP質譜儀，配ESI離子源（美國應用生物系統公司）；超高效液相色譜儀（SHIMADZU LC40）；AL104（萬分之一）電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；MS105DU（十萬分之一）微量分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Milli-Q 7015超純水制備儀（MERCK MILLIPORE默克密理博）；KQ5200DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥 對照品9種青霉素混標（批號21020687）來源于北京壇墨質檢科技有限公司；色譜純乙腈購于Thermo Fisher公司，色譜純甲酸購于國藥集團化學試劑有限公司。女金丸為網絡購買樣品，共30批次。

2 實驗方法

2.1 實驗條件

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液-乙腈；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。按照表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 質譜條件 采用SCIEX 5500+QTRAP質譜系統，電噴霧離子源（ESI源），多反應監測模式，離子源溫度為550℃，正離子模式掃描，離子源電壓為5.5 kv，噴霧氣（Gas1）55 Psi，輔助加熱氣（Gas2）55 Psi，氣簾氣30 Psi。優化得到各藥物的質譜參數見表2。

表2 各藥物質譜參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取上述對照品適量，置于10 mL量瓶中，加水使其溶解并定容至刻度，搖勻，得九種青霉素混合對照品儲備液。

精密量取上述混合對照品儲備液適量，用20%乙腈溶液稀釋至需要濃度，得9種青霉素混合對照品工作溶液。

2.2.2 供試品溶液 取供試品適量，研細，取約2 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入10 mL水，渦旋震蕩10 min。精密加入乙腈10 mL，渦旋混合1 min，再加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉混合粉末，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩3 min，離心（5 000 r/min）5 min。精密吸取5 mL上層清液，置于預先裝有100 mg C18、150 mg N-丙基乙二胺（PSA）、100 mg石墨化炭黑（GCB）的離心管中，渦旋2 min，離心（5 000 r/min）5 min。精密吸取上清液2 mL，置氮吹儀上于40℃水浴吹干，精密加入20%乙腈溶液1.0 mL，渦旋混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 線性范圍、檢測限及定量限考察 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，用20%乙腈溶液稀釋成系列濃度的混合對照品工作溶液，按“2.1”項條件測定。以各對照品質量濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標，以定量離子對峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸計算，結果色譜峰面積與其質量濃度在一定的范圍內具有良好的線性關系，r均大于0.999。精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，逐級稀釋后按“2.1”項條件測定，以離子對信噪比大于等于3考察其檢測限，以離子對信噪比大于等于10考察其定量限。結果見表3。

表3 各藥物成分線性關系、檢測限及定量限

2.4 精密度、重復性、穩定性實驗 精密吸取同一混合對照品工作溶液，按“2.1”項條件測定，連續進樣6次，其峰面積的RSD均小于4%，表明儀器精密度良好。精密稱取6份陰性樣品，每份約2.0 g，加對照品溶液，添加量為10.0 ng，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項條件分別進樣測定，計算各添加藥物成分的含量，其平均含量RSD均小于4%，表明該方法重復性好。取同一份供試品溶液，在室溫下放置 0、2、4、6、8、12 h 后，按“2.1”項條件分別進樣測定，記錄各藥物成分峰面積并計算其RSD值，均小于4%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定。結果見表4。

表4 各藥物成分的精密度、重復性、穩定性結果（n=6）

2.5 準確度試驗 精密稱取6份陰性樣品，每份約2.0 g，加對照品溶液，添加量為 10.0 ng，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項條件分別進樣測定。結果見表5。

表5 各藥物成分加樣回收率試驗結果（n=6）

續表5

2.6 實際樣品的檢測 利用建立的方法，對30批樣品進行檢測，結果在30批樣品中，有1批樣品檢出雙氯西林，含量為0.193 mg·kg-1，其他樣品均未檢出。對照品溶液（A）和陽性供試品溶液（B）多反應監測（MRM）色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液（A）和陽性供試品溶液（B）多反應監測（MRM）色譜圖

3 討論

3.1 色譜條件的優化 本試驗比較了流動相體積分數為0.1%的甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液、0.1%的甲酸水溶液-甲醇溶液、0.1%的甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液及0.1%的甲酸水溶液-乙腈溶液對目標物的分離效果。結果表明，流動相體積分數為0.1%的甲酸水溶液-乙腈溶液時，目標物離子化效率高，色譜峰形好。

3.2 前處理方法的優化 本方法比較了水、甲醇和乙腈，作為提取溶劑進行直接提取的提取效率，結果用水提取，乙腈萃取提取效率最好，但由于樣品基質復雜，基質干擾效應明顯，難于滿足回收率要求。本文選擇了QUECHERS鹽包萃取凈化法，通過優化PSA、GCB和C18用量比例，達到了最優凈化效果。

3.3 中藥丸劑抗生素殘留檢測的思考 中藥丸劑抗生素殘留，除了人為添加外，主要由蜂蜜殘留而引入。目前蜂蜜中抗生素的檢測已有報道。由于蜂蜜基質相對中藥更單一，對實驗的基質干擾更小，建議加強對中藥丸劑輔料蜂蜜的抗生素殘留進行檢測控制。

4 小結

本試驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測中藥丸劑中9種青霉素類抗生素殘留的分析方法。該方法具備靈敏度高、重復性好、分析時間短、取樣量小等優點，可為檢測中藥丸劑中抗生素殘留提供參考。