規模化奶牛場血清弓形蟲抗體的檢測

李青松

（四川省綿陽市經濟技術開發區動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

弓形蟲病（Toxoplasmosis）又稱弓漿蟲病或弓形體病，是一種全球性分布的寄生性人獸共患原蟲病［1］。引起該病的剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）屬于球蟲目弓形蟲科弓形蟲屬。動物感染弓形蟲后多表現為高熱、呼吸及神經系統癥狀、流產、死胎等。奶牛感染弓形蟲后病程多呈急性經過，表現出發熱，乳房炎，體表淋巴結腫大，共濟失調和感覺過敏等精神癥狀，嚴重者可導致死亡。部分奶牛呈隱性感染，沒有明顯癥狀。對死于弓形蟲病的奶牛進行剖檢，發現血液凝固不全，稀薄如水，頭頸部皮膚發生水腫；心臟出現心肌炎病變；各處淋巴結出現不同程度的腫大，尤以肺門淋巴結和腸系膜淋巴結最明顯；氣管黏膜有出血點；肺臟出現淤血呈絳紫色，切面流出泡沫樣液體；腎臟和肝臟表面出現壞死；皺胃黏膜出血、壞死，呈灰黑色，容易剝落；腸道重度充血，腸黏膜上有壞死灶，腸腔內出現大量滲出物。

目前，檢測弓形蟲病的血清學方法主要是酶聯免疫吸附法（ELISA）。該方法主要利用弓形蟲特異性抗原來測定宿主體內相應的抗體（IgA、IgM、IgG 和IgE）［2］。而間接酶聯免疫吸附法因檢測IgG抗體方便快捷、血樣用量少、結果較準確等優點而成為目前臨床上檢測弓形蟲病應用最廣泛的方法［3］。本試驗采集了綿陽和資陽兩個規模化奶牛場奶牛的血液樣本，通過間接ELISA 方法檢測血清中弓形蟲的IgG 抗體，以此了解兩場奶牛弓形蟲的感染情況，為弓形蟲病防控提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 IDEXX 弓形蟲抗體檢測試劑盒（Toxoplasma gondii Antibody Test Kit）購自愛德士元亨生物科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 2019 年8 月從四川省資陽市某規模化奶牛場采集奶牛血液樣本171 份，2020 年5月從綿陽市某規模化奶牛場采集奶牛血液樣本207 份。每頭奶牛無菌頸靜脈采血5 mL，血液樣本在室溫靜置30 min 后以3 000 r/min 離心5 min獲得血清，將上層血清用移液槍分裝至潔凈的離心管內，經過統一標記后置于－20 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 ELISA 檢測 根據IDEXX 弓形蟲抗體檢測試劑盒說明書操作，觀察并記錄產生顏色變化的反應孔，在450 nm處檢測反應孔中樣品的吸光度值并記錄。用愛德士元亨生物科技（北京）有限公司提供的數據分析軟件（xChek）處理數據，根據試劑盒說明書的計算方法計算結果，并以結果判定標準為依據進行結果判定。

1.4 復檢 經判定后，將結果為可疑的血清樣品重復上述ELISA步驟再次檢測。

1.5 數據分析 應用SPSS 22.0 軟件，采用卡方檢驗對試驗數據進行生物學統計分析，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 血液樣本數量 本試驗共采集資陽市某規模化奶牛場171 份血液樣本，其中7 份血液樣本在運輸過程中發生明顯溶血，3 份血液樣本體積過少，故待檢測血清樣本僅161份；共采集綿陽市某規模化奶牛場207 份血液樣本，其中3 份血液樣本在運輸過程中發生明顯溶血，2 份血液樣本體積過少，故待檢測血清樣本只有202 份。兩個規模化奶牛場的血液樣本共計363份。

2.2 資陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果 經過初次檢測，呈弱陽性的血清樣本有10 份，呈陰性的血清樣本有142 份，另有9 份血清的檢測結果可疑。可疑樣品經重復檢測后，其中2份檢測結果轉為弱陽性，4 份為陰性，剩余3 份仍為可疑。故該養殖場檢測結果顯示呈弱陽性的血清樣品有12份，陽性率為7.45%（12/161），呈陰性的血清樣本有146 份，陰性率為90.68%（146/161）。結果詳見表1。

表1 資陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果

2.3 綿陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果 經過初次檢測，血清樣本中呈弱陽性的有2 份，呈陰性的有192 份，另有8 份檢測結果可疑。將可疑樣品進行重復檢測，結果其中4 份轉為陰性，剩余4份仍為可疑。故該養殖場的檢測結果顯示呈弱陽性的血清樣品有2 份，陽性率為0.99%（2/202），呈陰性的血清樣品有196 份，陰性率為97.03%（196/202）。結果詳見表2。

表2 綿陽市奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果

2.4 兩個奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果統計分析 本試驗通過間接ELISA 檢測了四川省資陽市某規模化奶牛場的161 份血清樣本和綿陽市某規模化奶牛場的202 份血清樣本中的弓形蟲IgG 抗體，并利用卡方檢驗比較兩者陽性率是否存在顯著差異（表3）。從表3 可知，資陽養殖場的陽性率為7.45%（12/161），綿陽養殖場的陽性率為0.99%（2/202），兩場陽性率差異顯著（P＜0.05）。

表3 兩個奶牛場弓形蟲病血清學檢測結果比較

3 討論

3.1 兩個規模化養殖場奶牛弓形蟲病血清學結果分析 本次試驗共檢測奶牛血清樣本363 份，檢出14 份陽性血清，總陽性率為3.86%。其中，陽性率較高的是資陽奶牛場，為7.45%（10/161）。該結果高于2020 年葉勇剛等［4］對四川部分地區奶牛弓形蟲陽性率的調查結果（4.59%），同時也高于鄭州市（5.38%）［5］和遼寧省（6.0%）［6］的研究結果。分析造成這個結果的原因可能有以下幾方面：首先，該養殖場周圍可能存在患有弓形蟲病的流浪貓，作為弓形蟲終末宿主的流浪貓一旦進入養殖場，貓糞中排出的卵囊就會污染奶牛的飼料、飲水或食具等，而這些均可成為奶牛感染的重要來源［7］；其次，資陽地區氣候和地理條件更利于弓形蟲卵囊在外界長時間的存活，這與Sarvi［8］等報道的“溫暖多雨的埃及和阿富汗等國家牛弓形蟲的感染率遠遠高于伊朗”相似；最后，該場對弓形蟲病的防控措施不當，員工對奶牛弓形蟲感染的重視不足。雖然該場的弓形蟲陽性率較高，但是采樣時未發現有典型癥狀的奶牛，分析原因可能是感染奶牛為隱性感染，沒有明顯癥狀；其次血液樣品在冰箱中儲藏時間過久而導致假陽性結果等。

綿陽奶牛場陽性率為0.99%（2/202），不僅低于2020 年葉勇剛等［4］的研究結果，也低于廣西省（9.2%）和黑龍江省（11.7%）［6］的研究結果。這可能得益于該奶牛場對弓形蟲的防治較為重視，實行了較為嚴格的弓形蟲病防治措施，如對疑似患病牛及時隔離，并嚴格消毒等。

本試驗中兩個奶牛場的陽性率差異顯著（P＜0.05），分析原因可能與奶牛場地理位置和飼養管理模式不同有關，而具體因素（如弓形蟲防治措施，養殖場是否有流浪貓出入，奶牛飼料和飲水來源，養殖密度，引種歷史等）仍待進一步研究。

3.2 ELISA 試驗可疑結果分析 本試驗共檢測奶牛血清樣本363份，初檢時有17份檢測結果可疑，經復檢后，其中2 份轉為弱陽性，8 份轉為陰性，剩余7 份仍為可疑。造成復檢后可疑樣品結果改變的原因可能有以下幾方面：第一是樣品溶血，該ELISA法運用HRP標記IgG抗體，由于溶血時會釋放Hb，其具有的高過氧化物酶活性會產生非特異性顯色，同時發生溶血的血清顏色加深，也會致使測得的吸光度值增高，干擾結果的準確性；第二是細菌污染樣品，本試驗運用的酶標是HRP，該酶可能存在于污染樣品的細菌的菌體內，從而導致非特異性顯色，干擾結果的準確性；第三是樣本保存不當，樣品若置于外界超過1 d，會導致血清中的抗體免疫活性減弱而呈現假陰性結果，樣品置于冰箱的時間過久，在采用間接ELISA 檢測時由于血清中IgG抗體聚合形成多聚體，容易導致假陽性；第四是初檢過程中部分操作不規范，如洗滌時洗滌液過少或過多，洗滌液未與反應孔充分接觸而使孔壁洗滌不干凈，加樣時加樣速度過快而產生氣泡等［9-12］。復檢后仍有7 份樣品的結果為可疑，對此應該前往該奶牛場再次采樣并檢測。檢測時需嚴格按照弓形蟲抗體檢測試劑盒的說明書操作，也可以采用其他血清學方法進行輔助檢測，以增加檢測的特異性和敏感性，使檢測結果更加可靠。

3.3 奶牛弓形蟲病防治建議

3.3.1 請專業人員對奶牛場工作人員進行弓形蟲病防治培訓，根據實際情況制定規范合理的弓形蟲防治方案并嚴格執行。

3.3.2 定期隨機挑選不同圈舍的奶牛進行弓形蟲病檢測，一旦發現陽性奶牛，第一時間隔離治療，將陽性奶牛產生的排泄物及時處理，接觸物及時消毒，人員要做好個人防護，防止感染。同時，根據實際情況淘汰病牛，并對其他健康奶牛群進行藥物預防［13］。

3.3.3 定期打掃和消毒奶牛場，奶牛場內的排泄物應及時清理并進行無害化處理。可用55 ℃以上的熱水對已經污染的地方消毒［14］；消毒劑種類也需要定期更換。

3.3.4 死于或疑似死于弓形蟲病的奶牛尸體，應該燒毀或深埋。

3.3.5 堅持自繁自養，若要引種應提前對引進的奶牛進行血清學或病原學檢測，嚴禁引進弓形蟲病陽性奶牛，防止感染場內其他健康奶牛。

3.3.6 在養殖場及其周圍嚴禁養貓，并防止貓進入養殖場，嚴防奶牛的飼料和飲水接觸貓糞。

3.3.7 磺胺類藥物是治療奶牛弓形蟲病的首選藥，在發病初期及時用藥療效較好［15］。