一例豬圓環病毒2型和3型混合感染的實驗室診斷

拉馬甲甲，文建華，徐志文*

（1.四川省喜德縣農業農村局，四川 喜德 616750；2.四川農業大學動物醫學院，動物疾病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

豬圓環病毒（PCV）是一種單股負鏈共價閉合環狀DNA 病毒，屬圓環病毒科、圓環病毒屬［1］。目前全球已報道的共有4 種血清型，我國國內主要流行2型和3型，其中PCV 2型對豬群的傳染性和致病性最強，存在垂直傳播。豬圓環病毒2 型在國內最早于2001 年在京津冀地區的豬群中被分離鑒定［2］，豬圓環病毒3 型則由華南農業大學宋長緒教授課題組于2017 年首次在國內發現［3］。目前關于PCV3 的癥狀與致病性的相關研究還在進行，但已有報道顯示在出現繁殖障礙、免疫抑制、多器官炎癥及豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）的豬群中曾檢測出PCV3病原。

1 材料與方法

1.1 病料 病料采集于出現喘氣、發燒以及多器官功能衰竭的斷奶仔豬，主要采集肺臟與脾臟。

1.2 試劑 磁珠法總核酸提取試劑盒與配套儀器購買自國生生物技術有限公司；Taq PCR Master Mix、DEPC處理水購買自生工生物公司；DL2000 Marker 與反轉錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent Kit）購買自TAKARA（寶生物有限公司）。

1.3 樣品處理 檢查樣品，確定病變區域，從病變區域邊緣剪取并稱量樣品4 g，裝入無菌無DNase的EP管中，加入1 000 μL DEPC處理水，勻漿后置于－40 ℃下反復凍融3次，8 000 r/min離心5 min，取上清液，－80 ℃下儲存備用。

1.4 引物合成 根據GenBank 登錄的豬圓環病毒2 型（PCV2）、豬圓環病毒3 型（PCV3）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）的基因序列，利用DNAMAN軟件分析保守序列并設計引物，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 核酸提取與PCR檢測 提取樣品總DNA與總RNA，使用PCV2、PCV3、PRV、PPV引物分別對樣品總DNA 進行PCR 檢測；將總RNA 反轉錄后取得cDNA，使用PRRSV、CSFV 引物進行PCR 檢測。PCR反應體系程序分別見表2、表3。

表2 PCR反應體系

表3 PCR反應程序

2 結果

對樣品進行PCR擴增，并對PCR產物進行凝膠電泳檢測，結果顯示PRV、PRRSV、PPV、CSFV均呈陰性，PCV2 及PCV3 出現陽性條帶，其中1、2、3、4 號樣品檢出PCV2 陽性；1、5 號樣品檢出PCV3 陽性（結果如圖1、圖2）。判定1 號樣品為豬圓環病毒2型和3型的混合感染。

圖1 PCV2 PCR檢測結果

圖2 PCV3 PCR檢測結果

3 討論

豬圓環病毒2 型與3 型的混合感染在臨床上較為常見，二者臨床特征相近且均有較為嚴重的致病性，因此鑒別診斷對于疫病防控尤為重要［4］。

豬圓環病毒2 型主要侵襲胎兒心肌細胞、肝細胞和巨噬細胞，而在仔豬和成豬上只感染巨噬細胞，造成患病豬只的免疫系統損傷，引發T淋巴細胞和B 淋巴細胞的數量下降，從而導致患病豬免疫抑制。因此，豬群在感染豬圓環病毒后可能會進一步發生其他疫病的并發感染和傳播［5］。臨床上常見圓環病毒與其他各類細菌病或病毒病的混合感染現象，導致受感染的豬場損失擴大，同時防控難度更大。當豬群中檢測出圓環病毒2型或3 型感染或混合感染時，需要同步加強其他病毒病和細菌病的監測力度。

防控時應當注意將病死豬、撲殺豬及其污染物作無害化處理；對發病豬和疑似患病豬隔離單獨飼養，并加強其他豬群疫病的防控；加強豬場管理，定期對養殖器具與圈舍進行消殺。需要注意的是，豬圓環病毒對環境有較強的抵抗能力。研究表明，PCV2 在75 ℃下加熱15 min 感染活性幾乎不變，在80 ℃下加熱處理15 min 才會完全喪失感染活性［6］，因此常規的依賴溫度變化的消毒方法，如巴氏消毒法、干熱消毒法和濕熱消毒法對PCV 的殺滅效果相當有限［7］。由于PCV 在結構上不存在囊膜，因此病毒對有機溶劑（氯仿、酒精等）不敏感，而苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和強氧化劑等物質則對PCV 具有較強的抑制效果［8］。此外，豬場應當嚴格限制無關車輛和人員進出，加強飼養管理，防止外來病原體侵入和豬只應激而導致免疫力下降。