一例豬圓環(huán)病毒2型和3型混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

拉馬甲甲，文建華，徐志文*

（1.四川省喜德縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 喜德 616750；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，動物疾病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130）

豬圓環(huán)病毒（PCV）是一種單股負(fù)鏈共價閉合環(huán)狀DNA 病毒，屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬［1］。目前全球已報道的共有4 種血清型，我國國內(nèi)主要流行2型和3型，其中PCV 2型對豬群的傳染性和致病性最強(qiáng)，存在垂直傳播。豬圓環(huán)病毒2 型在國內(nèi)最早于2001 年在京津冀地區(qū)的豬群中被分離鑒定［2］，豬圓環(huán)病毒3 型則由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)宋長緒教授課題組于2017 年首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)［3］。目前關(guān)于PCV3 的癥狀與致病性的相關(guān)研究還在進(jìn)行，但已有報道顯示在出現(xiàn)繁殖障礙、免疫抑制、多器官炎癥及豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）的豬群中曾檢測出PCV3病原。

1 材料與方法

1.1 病料 病料采集于出現(xiàn)喘氣、發(fā)燒以及多器官功能衰竭的斷奶仔豬，主要采集肺臟與脾臟。

1.2 試劑 磁珠法總核酸提取試劑盒與配套儀器購買自國生生物技術(shù)有限公司；Taq PCR Master Mix、DEPC處理水購買自生工生物公司；DL2000 Marker 與反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScrip RT reagent Kit）購買自TAKARA（寶生物有限公司）。

1.3 樣品處理 檢查樣品，確定病變區(qū)域，從病變區(qū)域邊緣剪取并稱量樣品4 g，裝入無菌無DNase的EP管中，加入1 000 μL DEPC處理水，勻漿后置于－40 ℃下反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心5 min，取上清液，－80 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物合成 根據(jù)GenBank 登錄的豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）的基因序列，利用DNAMAN軟件分析保守序列并設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 核酸提取與PCR檢測 提取樣品總DNA與總RNA，使用PCV2、PCV3、PRV、PPV引物分別對樣品總DNA 進(jìn)行PCR 檢測；將總RNA 反轉(zhuǎn)錄后取得cDNA，使用PRRSV、CSFV 引物進(jìn)行PCR 檢測。PCR反應(yīng)體系程序分別見表2、表3。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果

對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示PRV、PRRSV、PPV、CSFV均呈陰性，PCV2 及PCV3 出現(xiàn)陽性條帶，其中1、2、3、4 號樣品檢出PCV2 陽性；1、5 號樣品檢出PCV3 陽性（結(jié)果如圖1、圖2）。判定1 號樣品為豬圓環(huán)病毒2型和3型的混合感染。

圖1 PCV2 PCR檢測結(jié)果

圖2 PCV3 PCR檢測結(jié)果

3 討論

豬圓環(huán)病毒2 型與3 型的混合感染在臨床上較為常見，二者臨床特征相近且均有較為嚴(yán)重的致病性，因此鑒別診斷對于疫病防控尤為重要［4］。

豬圓環(huán)病毒2 型主要侵襲胎兒心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而在仔豬和成豬上只感染巨噬細(xì)胞，造成患病豬只的免疫系統(tǒng)損傷，引發(fā)T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的數(shù)量下降，從而導(dǎo)致患病豬免疫抑制。因此，豬群在感染豬圓環(huán)病毒后可能會進(jìn)一步發(fā)生其他疫病的并發(fā)感染和傳播［5］。臨床上常見圓環(huán)病毒與其他各類細(xì)菌病或病毒病的混合感染現(xiàn)象，導(dǎo)致受感染的豬場損失擴(kuò)大，同時防控難度更大。當(dāng)豬群中檢測出圓環(huán)病毒2型或3 型感染或混合感染時，需要同步加強(qiáng)其他病毒病和細(xì)菌病的監(jiān)測力度。

防控時應(yīng)當(dāng)注意將病死豬、撲殺豬及其污染物作無害化處理；對發(fā)病豬和疑似患病豬隔離單獨(dú)飼養(yǎng)，并加強(qiáng)其他豬群疫病的防控；加強(qiáng)豬場管理，定期對養(yǎng)殖器具與圈舍進(jìn)行消殺。需要注意的是，豬圓環(huán)病毒對環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗能力。研究表明，PCV2 在75 ℃下加熱15 min 感染活性幾乎不變，在80 ℃下加熱處理15 min 才會完全喪失感染活性［6］，因此常規(guī)的依賴溫度變化的消毒方法，如巴氏消毒法、干熱消毒法和濕熱消毒法對PCV 的殺滅效果相當(dāng)有限［7］。由于PCV 在結(jié)構(gòu)上不存在囊膜，因此病毒對有機(jī)溶劑（氯仿、酒精等）不敏感，而苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和強(qiáng)氧化劑等物質(zhì)則對PCV 具有較強(qiáng)的抑制效果［8］。此外，豬場應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格限制無關(guān)車輛和人員進(jìn)出，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，防止外來病原體侵入和豬只應(yīng)激而導(dǎo)致免疫力下降。