ASFV核酸防污染恒溫隔絕式熒光PCR檢測方法的建立

陳雪蓉，徐 林，王遠(yuǎn)微，湯 承，岳 華*

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州動物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000）

非洲豬瘟（ASF）是非洲豬瘟病毒（ASFV）感染豬引發(fā)的一種急性、熱性、高度接觸性、致豬高死亡率的傳染性疾病，典型臨床癥狀是皮膚泛紅、高熱、腹瀉和出血［1-2］。由于ASF 的臨床癥狀很難與古典豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）區(qū)分開，使得ASF 難以準(zhǔn)確診斷，還需通過實驗室檢測來確診。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA 復(fù)制，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速等特點，被廣泛應(yīng)用于ASFV檢測中。但由于PCR較高的靈敏度，使其易受污染而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，進(jìn)而嚴(yán)重影響PCR檢測的準(zhǔn)確性。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測方法的靈敏度越來越高，造成污染的風(fēng)險也越來越高，造成PCR污染的主要污染源是擴(kuò)增產(chǎn)物和陽性對照物。由于拷貝數(shù)量極大，在PCR擴(kuò)增時的開蓋、搖動、吸樣過程中與空氣接觸形成氣溶膠體，污染空氣、試劑、移液器以及操作人員的手套衣物，使陰性對照反復(fù)出現(xiàn)污染，造成檢測無法正常進(jìn)行。

1 材料

1.1 臨床樣本 豬細(xì)小病毒（PPV）WH-1 株、豬瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GDr 株、豬源偽狂犬病毒（PRV）Bartha-k61 株、豬源乙腦病毒（JEV）SA14-14-2株，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）分離株swun620、非洲豬瘟病毒（ASFV）核酸，由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室提供，用于特異性評價。

51 份ASFV 陽性樣本及49 份ASFV 陰性樣本的核酸均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室（四川省ASF 定點檢測實驗室）提供，用于檢測方法的比較。

1.2 主要試劑 pMD19-T 克隆載體，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，DL500 DNA Marker，Premix Ex TaqTM（Probe qPCR Mix.with UNG），Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，PetNAD核酸萃取試劑盒。

1.3 主要儀器 移液器，核酸蛋白分析儀，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，熒光定量PCR 儀，小型離心機(jī)，POCKIT Micro Plus核酸八通道分析儀。

2 方法

2.1 引物、探針的合成 基于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第172 號推薦的熒光定量PCR 方法的引物和探針能滿足iiPCR 方法對引物和探針的要求，所以本研究采用該方法的引物和探針，擴(kuò)增片段長度為63 bp，引物序列為F：5′-CCTCGGCGAGCGCTT TATCAC-3′，R：5′-GGAAACTCATTCACCAAATC CTT-3′；探針序列為5′-FAM-CGATGCAAGCTTT AT-MGB-3′。引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 樣本處理

2.2.1 豬組織 對每種組織分別取樣和處理，取不少于2.0 g 組織，研磨后用5 倍體積滅菌PBS 懸浮，70 ℃滅活30 min，4 ℃下離心10 min，取上清液進(jìn)行核酸提取。

2.2.2 豬全血 直接取相應(yīng)量的全血進(jìn)行核酸提取。

2.3 核酸提取 用于特異性檢驗的毒株均采用酚-氯仿-異戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于－20 ℃保存?zhèn)溆茫琑NA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 ASFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采用前述引物以ASFV 陽性DNA 為模板進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶用Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收并連接到pMD19-T載體上，隨后轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆并提取質(zhì)粒，將測序正確的陽性質(zhì)粒作為本研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白分析儀測定其濃度（μg/mL），按照下述公式換算成拷貝/μL：

陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度（拷貝/μL）＝陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度×10-9×6.02×1023/（660×質(zhì)粒總長度）

2.5 反應(yīng)體系的優(yōu)化 參考沈思思［3］的研究，采用50 μL 反應(yīng)體系，對體系中的上下游引物濃度10 μmol/μL（0.5～5 μL）、熒光探針濃度10 μmol/μL（0.05～0.5 μL）、含UNG的Taq預(yù)混酶5 U/μL（22～28 μL）進(jìn)行優(yōu)化。以iiPCR儀器內(nèi)存卡中檢測前讀取的熒光值（A520）與檢測后讀取的熒光值（B520）的比值R來判定，取比值R最大時的相應(yīng)體系為最優(yōu)體系。

2.6 特異性評價 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法對PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸樣本進(jìn)行檢測，并設(shè)ASFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，陰性對照的模板用等量去離子水代替，以評價ASFV iiPCR方法的特異性。

2.7 靈敏度測定 將陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋（10n～100）后作為模板，陰性對照的模板用等量去離子水代替，測定本研究建立的ASFV 防污染iiPCR方法的檢測下限。

2.8 穩(wěn)定性驗證 用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法對6 個稀釋度的ASFV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，評價其批內(nèi)重復(fù)性；同時以這些陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每間隔一天進(jìn)行3次獨立檢測，檢測其批間重復(fù)性。

2.9 臨床樣本檢出情況的比較 采用本研究建立的iiPCR 和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部172 號公告推薦的熒光定量PCR 方法同時對51 份ASFV 陽性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本核酸進(jìn)行檢測，統(tǒng)計并比較兩種檢測方法對ASFV的檢出情況。

3 結(jié)果

3.1 優(yōu)化后的ASFV防污染iiPCR反應(yīng)體系 UNG酶防污染iiPCR反應(yīng)體系的總量為50 μL，優(yōu)化后的體系見表1。

表1 優(yōu)化后的防污染iiPCR反應(yīng)體系

3.2 防污染iiPCR 的特異性 如圖1 所示，用本研究建立的ASFV 防污染iiPCR 方法從ASFV 陽性核酸樣本中擴(kuò)增出63 bp 的目的片段，而對PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的檢測結(jié)果均為陰性，表明該檢測方法的特異性良好。

圖1 防污染iiPCR檢測及其產(chǎn)物的電泳結(jié)果

3.3 防污染iiPCR 的靈敏性 用核酸蛋白分析儀測定ASFV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為176 μg/mL，代入公式換算核酸濃度為2.55×1012拷貝/μL。對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋后（2.55×1011～2.55×100），檢測結(jié)果顯示iiPCR 方法對ASFV 核酸的最低檢測限為25.5拷貝/μL。

3.4 防污染iiPCR 的穩(wěn)定性 試驗結(jié)果顯示該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.86%～2.22%，批間變異系數(shù)為1.66%～3.82%（表2）。6個梯度的變異系數(shù)均小于5%，表明建立的ASFV 防污染iiPCR 方法在批內(nèi)和批間都具有較好的穩(wěn)定性。

表2 防污染iiPCR的穩(wěn)定性

3.5 防污染iiPCR 的效果驗證 UNG-ASFV DNA 陽性模板的濃度為6.08×1010拷貝/μL，將陽性模板梯度稀釋后作為模板（陰性對照的模板用等量去離子水代替），在37 ℃條件下作用10 min，再根據(jù)最優(yōu)體系來進(jìn)行iiPCR 擴(kuò)增，檢測結(jié)果顯示：本研究建立的防污染ASFV iiPCR 可以有效消除6.08×105拷貝/μL 的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明UNG 酶可以有效防止污染，且UNG酶在PCR預(yù)變性解鏈時失活，不會影響PCR后續(xù)反應(yīng)。

3.6 臨床樣本檢測結(jié)果的比較 本研究建立的防污染iiPCR與傳統(tǒng)熒光PCR檢測的符合率見表3。從表3 可見，本研究建立的iiPCR 方法和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦方法對ASFV陽性樣本和陰性樣本的核酸檢測結(jié)果一一對應(yīng)，完全一致，表明本研究建立的防污染iiPCR檢測方法準(zhǔn)確可靠。

表3 兩種方法對ASFV檢測結(jié)果的比較

4 討論

4.1 ASFV防污染iiPCR方法的優(yōu)勢 恒溫隔絕式熒光PCR（iiPCR）是一種基于Rayleigh-Benard對流原理設(shè)計的新型熒光PCR技術(shù)，該方法對于DNA 和RNA 的檢測都具有極好的靈敏度和特異性［3］。與實時熒光定量PCR 檢測技術(shù)，需要瓊脂糖凝膠電泳鑒定的傳統(tǒng)PCR 或熱循環(huán)式PCR 不同的是，該技術(shù)實現(xiàn)了核酸分析儀的小型化。本研究基于UNG 酶的生物學(xué)特性，在iiPCR 反應(yīng)體系中引入UNG 酶，對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了防污染的ASFV iiPCR 檢測方法。該方法對實驗室環(huán)境及操作人員的要求不嚴(yán)格，對PCR反應(yīng)的反應(yīng)性、便捷性和時效性無影響，也不影響后續(xù)實驗，同時可以解決陽性對照物及擴(kuò)增產(chǎn)物對PCR擴(kuò)增體系污染的問題，降低假陽性的出現(xiàn)概率，提高檢測方法的可靠性。

Biagetti 等［4］在2018 年建立了加入UNG 酶的基于嵌合DNA/LNA 的生物傳感器用于檢測非洲豬瘟病毒的方法，該方法在病毒載量較低時，檢測靈敏度顯著降低［5］。本研究用dUTP 取代dTTP，對ASFV 基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量含尿嘧啶的U-DNA，將其作為后續(xù)實驗的陽性模板。進(jìn)行PCR 反應(yīng)前在反應(yīng)體系中引入UNG酶，對UNG 酶的用量和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。UNG 酶可將污染的含尿嘧啶的U-DNA 水解產(chǎn)生脫嘌呤嘧啶位點，失去模板的功能，而UNG 在預(yù)變性過程中被滅活而不影響PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，即使高濃度的U-DNA 污染PCR 反應(yīng)體系，也可以有效防止污染，而且對PCR 擴(kuò)增無影響。本方法不僅能快速地消除污染，且上機(jī)檢測時間僅需42 min，檢測速度更快，操作更簡捷，對實驗室環(huán)境和操作人員的要求不高，能夠有效提高ASFV PCR 檢測的準(zhǔn)確性，防止假陽性的出現(xiàn)，為ASFV 的現(xiàn)場檢測提供了一種可靠的防污染方法。

4.2 基于UNG酶的防污染PCR方法的優(yōu)勢 為了防止PCR 污染，很多技術(shù)方法被應(yīng)用，主要有物理隔絕法，紫外照射法，酶消化法，化學(xué)修飾法，DEAE 纖維素法等，但是這些方法費時費力，且效果不理想。物理隔絕法是將PCR 實驗室分為四個區(qū)域，實驗嚴(yán)格單向進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)），防止雜質(zhì)對試劑、樣本的污染，但還是無法避免因氣溶膠產(chǎn)生的污染。紫外照射法操作較簡單且成本低，但所需時間較長。Glushkov 等［6］發(fā)現(xiàn)DEAE法最高能將污染降低106 倍，但是此方法操作過程較為繁瑣，所需時間較長。

UNG 是一種DNA 修復(fù)酶，能識別并去除DNA 中的尿嘧啶，將試劑中的dNTP 替換成dUTP，在高溫條件下發(fā)生斷裂，在預(yù)變性過程中UNG 被滅活而不影響后續(xù)PCR 擴(kuò)增［7］。在PCR混合試劑中加入UNG，每次擴(kuò)展前在37 ℃下作用10 min 左右就能消化可能存在的污染產(chǎn)物，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，整個過程也是無需開管，不會再次污染。這種防污染手段所需時間較少，操作簡單，因此利用該酶的這種特性建立的防污染方法在一些病原檢測中得到了廣泛應(yīng)用［8］。