南江黃羊體表膿腫病原菌的分離鑒定與藥敏試驗

譚玉祥，何興隆，魏 甬

（1.巴中市南江黃羊科學研究所，四川 南江 635600；2.四川省南江縣動物疫病預防控制中心，四川 南江 635600；3.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

體表膿腫病是南江黃羊養殖生產中的常見病，以軀干體表出現局部膿腫病灶為特征，季節性不明顯，各個日齡階段均可發生，引起局灶性紅腫熱痛、個體生長遲滯等。通常在膿腫出現波動感后，采取外科手術式切口、排膿、沖洗、消毒、抗菌藥物灌注，能獲得一定的療效。若治療不當或治療不及時，病灶可逐漸擴大、化膿甚至出現全身敗血癥，從而給南江黃羊防疫管理、產品安全等方面帶來較大的損失。本文就該病致病菌的分離鑒定及抗菌藥物篩選開展探討。

1 材料與方法

1.1 病料 從南江縣部分規模羊場患病羊的頸部、胸部、腹部及后軀部等體表膿腫病灶處經局部剪毛、碘酒消毒及酒精脫碘消毒后，用滅菌注射器具穿刺無菌采集膿液樣品。

1.2 主要試劑 綿羊血瓊脂平板，MH 瓊脂培養基，普通肉湯培養基，藥敏紙片，細菌DNA提取試劑盒，革蘭氏染色試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離及形態觀察 用無菌接種環采取病羊膿液樣品，無菌條件下劃線接種于綿羊血瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，再對單菌落進行純化培養。參照革蘭氏染色試劑盒說明書對細菌進行染色，在光學顯微鏡下觀察結果。

1.3.2 細菌16S rDNA 鑒定 將純化培養的細菌無菌接種至普通營養肉湯培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中振蕩培養18 h，用DNA提取試劑盒提取細菌DNA。采用細菌通用16S rDNA基因引物進行PCR擴增，引物設計及PCR擴增條件參照張玲等［1］的試驗報告。PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在GenBank數據庫中比對，根據同源性高低確定細菌種屬。

1.3.3 藥敏試驗 參照向益等［2］的方法進行藥敏試驗，根據紙片法抗菌藥物敏感試驗標準（WST 125-1999）及美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準與指南進行結果判定。

2 結果

2.1 細菌分離及形態觀察 從5 只病羊不同部位的膿腫液中共分離出4 株細菌，將其編號為①～④號，具體情況見表1。①～④號分離菌接種至血平板后，均出現透明的β溶血環。①號為革蘭氏陰性菌，呈細桿狀，單個散在或成對存在；②③號為革蘭氏陽性菌，呈球桿狀，兩端鈍圓，單個散在存在；④號為革蘭氏陰性菌，呈球桿狀。

表1 細菌培養檢測結果

2.2 細菌16S rDNA 鑒定 用PCR 擴增4 株細菌的16S rDNA，測序結果經比對后發現：①號為短小芽孢桿菌；②③號均為假結核棒狀桿菌；④號為支氣管敗血波氏桿菌。

2.3 藥敏試驗 ①號短小芽孢桿菌對頭孢吡肟和頭孢西丁有耐藥性，對其余10種藥物敏感或中度敏感，詳見表2。②號假結核棒狀桿菌對12 種藥物敏感或中度敏感，詳見表3。③號假結核棒狀桿菌對頭孢西丁和鏈霉素存在耐藥性，對其余10 種藥物敏感或中度敏感，詳見表4。④號支氣管敗血波氏桿菌對頭孢西丁耐藥，對其余11種藥物敏感或中度敏感，詳見表5。

表2 ①號短小芽孢桿菌的藥敏試驗 mm

表3 ②號假結核棒狀桿菌的藥敏試驗 mm

表4 ③號假結核棒狀桿菌的藥敏試驗 mm

表5 ④號支氣管敗血波氏桿菌的藥敏試驗 mm

3 討論

本研究從病羊的膿腫液病料中分離培養出4株細菌，通過形態學及16S rDNA鑒定為短小芽孢桿菌、假結核棒狀桿菌、假結核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌，這4株細菌都具有溶血性。

短小芽孢桿菌通常作為一種有益菌應用于各個領域［3］，由于其具有溶血性，目前在人類醫學上正研究用其治療血栓。在植物方面，由于其具有抑制細菌生長的作用，目前正研究將其作為一種生物拮抗劑用于生物防治。短小芽孢桿菌還可用于傳統發酵食品的生產、廢水處理和環境污染物的降解。然而也有很多報道指出短小芽孢桿菌能夠引起人類疾病，如抑制精子活動、破壞精子細胞膜通透性屏障、破壞線粒體以及抑制胞漿NAD 還原反應等［4］。本研究從病羊的膿腫液中分離出短小芽孢桿菌，提示該菌可能對羊具有一定的致病性，但是關于該菌對山羊的具體致病機制仍需進一步研究。

假結核棒狀桿菌是一種兼性細胞內寄生菌，具有溶血性。該菌侵入宿主后，隨血液傳播，在淋巴間隙或組織間形成化膿性病灶。目前，有較多的關于該菌引起羊患膿腫病的報道，并且放牧羊的發病率很高，通常引起山羊體表淋巴結腫脹化膿，且能導致體內淋巴結或內臟膿腫［5］。隨著抗生素的濫用，該菌的耐藥性逐漸升高，所以在用藥前進行藥敏試驗可有效縮短治療時間，節約成本。李基棕等［6］從山羊肩前淋巴結膿腫樣本中分離到一株假結核棒狀桿菌，發現其對鏈霉素和環丙沙星耐藥，這與本研究結果存在差異，可能與菌株來源不同有關。

目前，支氣管敗血波氏桿菌已從患病的豬［7］、小熊貓［8］、貓［9］、林麝［10］和兔［11］身上被分離出來。支氣管敗血波氏桿菌主要引起呼吸道疾病，引起動物鼻炎、支氣管肺炎或膿皰型肺炎等。本研究從病羊的膿腫病料中分離出了一株支氣管敗血波氏桿菌，可見該菌也會引起動物其他組織感染。研究發現支氣管敗血波氏桿菌可從家畜傳染給人類，并對免疫功能低下的人群可能造成嚴重感染，所以該菌具有一定的公共衛生學意義［12］。從不同動物身上分離的支氣管敗血波氏桿菌菌株存在不同程度的耐藥性，但總的來說，所有支氣管敗血波氏桿菌分離株均對頭孢類藥物耐藥，所以臨床上應選擇性地用藥治療。

4 結論

短小芽孢桿菌是否能引起山羊致病仍需進一步研究，假結核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌可能是引起此次南江黃羊患皮膚膿腫病的病原。此外，在養羊生產中可交叉使用克拉霉素、環丙沙星、青霉素和四環素等藥物，用于治療由短小芽孢桿菌、假結核棒狀桿菌和支氣管敗血波氏桿菌引起的感染。