桿狀病毒凋亡抑制蛋白5在卵巢漿液性癌中的表達及意義

王 倩, 徐劍豪, 顧婷婷, 干文娟

(1. 蘇州大學醫學部, 江蘇 蘇州, 215000;2. 江蘇大學附屬昆山市第一人民醫院 病理科, 江蘇 昆山, 215300;3. 蘇州大學附屬獨墅湖醫院 病理科, 江蘇 蘇州, 215000)

卵巢癌是全球范圍內第3大常見的婦科惡性腫瘤，且病死率高居婦科惡性腫瘤的第1位[1], 患者5年生存率低于45%[2]。漿液性癌是卵巢癌最常見的病理類型[3], 可分為卵巢高級別漿液性癌(HGSOC)和卵巢低級別漿液性癌(LGSOC), 而兩者的臨床預后相差甚遠[4]。本研究從GEO數據庫中下載GSE73638、GSE27651、GSE14001數據集，應用GEO2R在線分析工具篩選卵巢漿液性癌的差異表達基因(DEGs), 并對DEGs進行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，發現桿狀病毒凋亡抑制蛋白5(BIRC5)是卵巢漿液性癌的關鍵分子。BIRC5屬于細胞凋亡抑制蛋白家族成員[5], 是含有細胞凋亡重復(BIR)結構域的142個氨基酸的多功能小蛋白質[6]。已有眾多研究發現BIRC5在乳腺癌[7]、肺腺癌[8]、胰腺癌[9]、尤文肉瘤[10]等多種腫瘤中過度表達，并與患者的預后密切相關[11], 但BIRC5在卵巢癌中的表達情況及潛在機制等尚有待進一步探索。本研究分析BIRC5在卵巢漿液性癌中的表達及病理意義，并初步探討 BIRC5對卵巢漿液性癌發展過程的調控機制，以期為卵巢漿液性癌的個性化治療、診斷和預后評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 生物信息學檢測方法

1.1.1 數據集篩選: 從GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[12]中篩選人類HGSOC、LGSOC的芯片數據集，包括GSE73638、GSE27651和GSE14001數據集。GSE73638的平臺是GPL20967, 包含13個HGSOC樣本和7個LGSOC樣本; GSE27651和GSE14001的平臺是GPL570, GSE27651包含21個HGSOC樣本和13個LGSOC樣本, GSE14001包含10個HGSOC樣本和10個LGSOC樣本。

1.1.2 DEGs篩選: 以P<0.05和|logFC|>1為閾值，應用GEO2R在線分析工具對GSE73638數據集和GSE27651數據集的DEGs進行交集檢測。由于上述閾值篩選到的DEGs有限，為了保證有足夠的DEGs用于后續分析, GSE14001數據集中的DEGs僅以P<0.05為閾值進行檢測。應用GSE14001數據庫對第1次檢測到的DEGs(GSE73638、GSE27651數據集的重疊DEGs)進行交集分析，再使用在線Venn軟件獲取數據集之間的重疊DEGs。

1.1.3 DEGs的GO和KEGG富集分析: 應用WebGestalt在線分析工具對DEGs進行GO和KEGG通路富集分析，并用R軟件(ggplot2包)繪制結果，P<0.05為差異具有統計學意義。

1.1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建和關鍵基因篩選: 首先，應用String在線工具(http://string-db.org)對重疊DEGs構建PPI網絡(設置相互作用得分>0.700); 然后，應用Cytoscape軟件的插件MCODE根據拓撲結構對給定的網絡進行聚類，從而找到緊密連接的區域; 最后，應用Cytoscape軟件的另一個插件程序CytoHubba以Radiality算法對頂級節點進行排序，篩選前10個關鍵基因。

1.1.5 關鍵基因與預后的關系分析: 通過GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)驗證關鍵基因在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平，并分析關鍵基因與卵巢癌患者總體生存情況和分期的相關性。

1.2 臨床標本收集

收集2014年1月—2021年8月在昆山市第一人民醫院接受手術治療的58例卵巢漿液性癌患者的卵巢癌組織(石蠟包埋)，包括38例HGSOC和20例LGSOC(分別納入HGSOC組和LGSOC組)，病理診斷參照國際癌癥研究機構發布的2014版世界衛生組織(WHO)女性生殖系統腫瘤分類。所有患者術前均未接受放療和化療，且臨床病理資料完整。根據國際婦產科聯盟(FIGO)2014年分期標準對卵巢漿液性癌組織標本進行病理分期。

1.3 免疫組織化學檢測方法

BIRC5、Ki-67和TP53蛋白檢測采用免疫組織化學GTvisionTM二步染色法。兔抗人BIRC5單克隆抗體(貨號GT204802，即用型)、鼠抗人Ki-67單克隆抗體(貨號GT209429, 即用型)、鼠抗人TP53單克隆抗體(貨號GM700102, 即用型)均購自上海基因科技公司，二氨基聯苯胺(DAB)試劑購自上海基因科技公司，用已知陽性組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。以出現棕黃色顆粒為陽性, BIRC5陽性反應定位于細胞膜和細胞漿, Ki-67、TP53陽性反應定位于細胞核，背景無染色。采用Allred評分法[13]對BIRC5、TP53免疫組織化學檢測結果進行分級: ① 染色強度，陰性為0分、弱棕黃色為1分、中等棕黃色為2分、強棕黃色為3分; ② 陽性細胞所占比例, 0～1/100為1分、>1/100～1/10為2分、>1/10～1/3為3分、>1/3～2/3為4分、>2/3為5分。總積分為染色強度評分與陽性細胞所占比例評分相加所得, 0～2分為陰性，≥3分記為陽性。Ki-67表達水平的判定以20%陽性腫瘤細胞為臨界值, ≤20%為低表達, >20%為高表達。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件處理數據，不同臨床病理特征的卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達情況比較采用卡方檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評價BIRC5、Ki-67、TP53對LGSOC與HGSOC的鑒別診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 生物信息學檢測結果

Venn圖顯示, GSE73638數據集與GSE27651數據集的重疊DEGs包括157個上調基因和204個下調基因(圖1A)，進一步應用GSE14001數據集對上述重疊DEGs進行交集分析，最終得到79 個上調基因和85個下調基因(圖1B)。

A: GSE73638、GSE27651數據集的重疊DEGs; B: GSE14001數據集與GSE73638+GSE27651數據集的重疊DEGs。圖1 GSE73638、GSE27651和GSE14001數據集重疊DEGs的Venn圖

本研究先利用String數據庫構建重疊DEGs的PPI網絡(圖2A)，再應用Cytoscape軟件進行可視化分析并構建出一個包括115個節點和894條邊的 PPI 網絡(圖2B); 應用MCODE插件將PPI網絡分為4個模塊(圖2C), 第1個模塊有38個節點和661條邊(MCODE得分35.730分)，第2個模塊有7個節點和21條邊(MCODE得分7.000分)，第3個模塊有5個節點和10條邊(MCODE得分5.000分), 第4個模塊有3個節點和3條邊(MCODE得分3.000分); 應用CytoHubba插件篩選出前10個Hubba節點，即BIRC5、CDC20、CDK1、CDKN3、MKI67、NUSAP1、RRM2、TOP2A、TPX2和UBE2C基因，以便使用徑向拓撲技術進一步研究(圖2D)。

A: String數據庫中重疊DEGs的PPI網絡; B: Cytoscape軟件建立的PPI網絡; C: MCODE插件拆分的PPI網絡的4個模塊; D: CytoHubba插件篩選出的關鍵基因。圖2 PPI網絡構建和關鍵基因篩選結果

GEPIA數據庫分析結果顯示，10個關鍵基因中，僅BIRC5與卵巢癌患者總體生存情況相關。GEPIA在線網站包含了TCGA數據庫中的426例卵巢癌組織和8例癌旁組織的信息，相較于癌旁組織,BIRC5在卵巢癌組織中高表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A; Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌的BIRC5表達水平依次呈下降趨勢，但組間差異無統計學意義(F=2.314,P=0.109), 見圖3B; TCGA數據庫分析結果提示,BIRC5表達與卵巢癌患者的總生存期呈正相關(P=0.014), 即BIRC5表達水平越高，卵巢癌患者的總生存期越長，見圖3C。

A: BIRC5在卵巢癌組織(n=426)和癌旁組織(n=8)中的表達水平; B: BIRC5表達與卵巢癌分期的關系; C: BIRC5低表達與高表達患者的生存分析。圖3 基于GEPIA數據庫分析BIRC5與卵巢癌分期和總生存期的相關性

GO和KEGG富集分析結果顯示, 164個DEGs主要富集在有絲分裂細胞周期、細胞器分裂、核分裂等生物學過程(圖4A)和癌癥相關的微小RNA等通路(圖4B)中。

A: GO富集分析的前10個生物學過程; B: KEGG通路富集分析的前10個通路。圖4 HGSOC和LGSOC重疊DEGs的GO和KEGG通路富集分析結果

2.2 BIRC5蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達情況

免疫組織化學檢測結果顯示, LGSOC組中，癌組織的BIRC5蛋白陽性表達率與癌旁組織比較，差異無統計學意義(χ2=1.026,P=0.311); HGSOC組中，癌組織的BIRC5蛋白陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=44.333,P<0.001)。見表1。

表1 BIRC5蛋白在卵巢癌組織及癌旁組織中的表達[n(%)]

2.3 卵巢癌組織中BIRC5、TP53和Ki-67蛋白表達情況

觀察LGSOC、HGSOC的蘇木素-伊紅(HE)染色形態表現和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫組織化學表達情況，結果顯示，BIRC5、TP53和Ki-67蛋白在HGSOC癌組織中高表達，在LGSOC癌組織中低表達，見圖5。

圖5 HGSOC、LGSOC的HE染色形態表現和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫組織化學染色圖(GTvisionTM二步染色法,放大100倍)

2.4 卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達與臨床病理特征的關系

HGSOC患者的BIRC5蛋白陽性表達率高于LGSOC患者，年齡>60歲、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67蛋白>20%患者的BIRC5蛋白陽性表達率分別高于年齡≤60歲、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67蛋白≤20%的患者，差異均有統計學意義(P<0.05); 不同糖類抗原125水平、不同TP53蛋白表達情況患者的BIRC5蛋白表達情況比較，差異無統計學意義(P>0.05), 見表2。由此提示，卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達情況與年齡、FIGO分期、Ki-67蛋白表達和病理類型相關(P<0.05)，與糖類抗原125、TP53蛋白表達無關(P>0.05)。

表2 不同臨床病理特征的卵巢漿液性癌患者BIRC5蛋白表達情況比較[n(%)]

2.5 BIRC5、Ki-67、TP53對卵巢漿液性癌的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示, BIRC5、Ki-67鑒別診斷LGSOC與HGSOC的曲線下面積(AUC)分別為0.909、0.931, 均大于TP53的0.790, 見表3、圖6。

表3 BIRC5、Ki-67、TP53對卵巢漿液性癌的診斷價值

圖6 BIRC5、Ki-67、TP53鑒別診斷LGSOC與HGSOC的ROC曲線

2.6 LGSOC、HGSOC患者的生存預后分析

HGSOC組患者的總體生存率低于LGSOC組，但差異無統計學意義(χ2=3.522,P=0.061), 見表4。根據BIRC5蛋白檢測結果將58例卵巢漿液性癌患者分為BIRC5陽性組和BIRC5陰性組，每組29例。BIRC5陽性組患者與BIRC5陰性組患者的總體生存率比較，差異無統計學意義(χ2=1.074,P=0.300), 見表5。

表4 LGSOC、HGSOC患者的預后結局比較[n(%)]

表5 BIRC5陽性、BIRC5陰性卵巢漿液性癌患者的預后結局比較[n(%)]

3 討 論

卵巢癌是臨床常見的女性生殖道惡性腫瘤，居全球女性癌癥相關死亡原因的第8位[2]。近年來，卵巢癌的診斷、治療和預后判斷方面并無顯著改善[14], 因此亟需尋找可用于卵巢癌診斷、治療和預后評估的分子標志物。BIRC5又稱Survivin，定位于人類染色體17q25位點，是細胞凋亡抑制蛋白家族的成員，可抑制細胞凋亡。研究[15]表明, BIRC5受到染色體區域維持因子1(CRM1)的正向調控，促進了卵巢癌的發展。YIN S N等[16]對卵巢癌 OVDM1細胞系進行生物信息學分析，證實BIRC5在卵巢癌中具有關鍵作用。HE X Y等[17]進行Meta分析發現，BIRC5高表達與卵巢癌FIGO分期密切相關。OZRETIC P等[18]發現, Hedgehog信號通路與卵巢癌的病理分型有關，且BIRC5是該通路的一個新靶點。WANG B J等[19]也利用原位卵巢癌小鼠模型驗證了微小RNA-203(miR-203)通過靶向BIRC5抑制上皮間質轉化(EMT), 進而抑制卵巢腫瘤轉移。

本研究通過GEO數據庫分析了HGSOC和LGSOC的3個數據集(GSE73638、GSE27651和GSE14001數據集)，共獲得164個重疊DEGs, 進一步行GO和KEGG功能富集分析發現BIRC5是卵巢漿液性癌的關鍵基因; GEPIA生物信息學網站分析結果顯示,BIRC5基因與卵巢癌患者總體生存情況相關，即BIRC5表達越高，卵巢患者的生存周期就越長; 與癌旁組織相比,BIRC5在癌組織中的表達水平顯著更高。本研究分析臨床標本后發現, BIRC5蛋白在卵巢癌組織中的表達水平相較癌旁組織中顯著升高，且BIRC5表達與卵巢漿液性癌患者FIGO分期和Ki-67表達密切相關，即BIRC5高表達可能提示癌細胞出現浸潤、轉移或復發，腫瘤惡性程度高，患者預后差。本研究還發現，BIRC5陽性組患者與BIRC5陰性組患者的總體生存率雖無統計學差異，但BIRC5陽性組患者生存情況呈現劣于BIRC5陰性組患者的趨勢，與基于TCGA腫瘤樣本的GEPIA數據庫分析結果不一致。考慮原因如下: 首先，本研究樣本量有限(卵巢漿液性癌58例)，分可能存在選擇偏倚; 其次，數據庫BIRC5表達數據為mRNA水平，而非蛋白質水平，因此需考慮BIRC5轉錄后調控的情況，而本研究是通過免疫組織化學法檢測樣本的BIRC5蛋白質表達量，更為準確; 最后，數據庫檢測的癌組織中不僅包括癌成份，還含有很多間質成分如炎細胞、成纖維細胞等，因此BIRC5表達數據不能完全等同于癌組織的BIRC5表達情況，而本研究通過免疫組織化學法檢測樣本BIRC5水平，可在顯微鏡下精準測量癌成份的BIRC5表達，更為準確。

相關研究[20]指出，細胞核分裂增殖指標Ki-67可作為卵巢漿液性癌的預后指標。TP53常被用作鑒別診斷HGSOC和LGSOC的免疫組織化學指標，且SU D等[21]發現TP53突變可促進卵巢漿液性癌的發生與發展。本研究發現, BIRC5、Ki-67在卵巢漿液性癌中均呈高表達，且BIRC5、Ki-67鑒別診斷LGSOC與HGSOC的AUC相似，均優于TP53的AUC, 提示BIRC5未來或可作為診斷卵巢癌的新指標。本研究中，HGSOC組患者的總體生存率低于LGSOC組，但差異無統計學意義，這可能是因為本研究樣本數量較少。本研究還發現, BIRC5表達與Ki-67表達有關，與TP53表達無關，提示BIRC5可能是通過調控Ki-67表達而非TP53信號通路來促進卵巢癌的發生與發展，也提示BIRC5屬于一種促癌基因。本研究存在一定局限性，例如樣本量偏少，且未明確研究BIRC5對卵巢漿液性癌的具體調控機制，未來有待進一步深入探討。

綜上所述,BIRC5是卵巢漿液性癌的關鍵基因，可作為該疾病診斷和生存預后判斷的新指標。BIRC5屬于促癌基因，可能通過調控Ki-67表達而非TP53信號通路促進卵巢漿液性癌的發生與發展。