抑制miR-33表達對急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺纖維化的影響及機制研究

龍光文，張謙，楊秀林，吉春玲，董裕康

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是急性肺損傷（ALI）較為嚴重的臨床表現，常伴有炎癥反應、肺纖維化和肺功能降低，其中肺纖維化是導致ARDS發病和死亡的主要原因［1］。ARDS的治療方式主要有機械通氣、肺水清除與液體管理等［2-3］，但這些支持性治療并不能逆轉ARDS的病理生理過程，且目前仍然無有效的治療藥物。有研究發現，轉化生長因子（TGF）-β1/Smad信號通路在ARDS肺纖維化中發揮著重要作用［4］。TGF-β1通過激活下游Smad信號通路促進肺成纖維細胞過度增殖和分化，進而促進膠原等細胞外基質在肺間質和肺泡細胞過度積累，導致肺纖維化發生和發展［5］。Hu等［6］發現抑制TGF-β1/Smad通路可減輕ARDS肺纖維化的炎癥反應，是改善ARDS肺纖維化的有效措施。miR-33是一種高度保守的miRNA，可調節脂質代謝和炎癥反應，同時促進組織纖維化［7-8］。Nishiga等［9］發現，抑制miR-33表達可抑制心肌成纖維細胞的增殖，進而抑制心肌纖維化。然而，miR-33是否通過調控TGF-β1/Smad信號通路參與ARDS肺纖維化過程目前尚不明確。本研究采用脂多糖（LPS）頸部氣管滴注構建ARDS模型，探討抑制miR-33表達對ARDS大鼠肺纖維化的影響及其可能作用機制，以期為ARDS提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量190～210 g，購于西南醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SYSK（川）2018-065。所有大鼠均在12 h晝夜循環，溫度（24±2）℃和濕度45%～55%的環境下飼養，正常給予食物和水。

1.1.2 主要試劑與儀器 miR-33 antagomir及其陰性對照（antagomir-NC）購自上海GenePharma公司；LPS購自上海阿拉丁試劑有限公司；兔抗TGF-β1、Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、GAPDH及辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體均購自英國Abcam公司；Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司；miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；RT2miRNA First Strand Kit（331401）購自美國SABiosciences公司；GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司；iScript cDNA Synthesis和SYBR Green試劑盒均購自美國BIO-RAD公司；羥脯氨酸（Hyp）含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PT1000血氣分析儀購自武漢明德生物科技股份有限公司；化學發光凝膠成像系統和實時熒光定量PCR（qPCR）儀器均購自美國BIO-RAD公司；光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 采用隨機數字表法將60只大鼠分成假手術組（Sham組）、ARDS模型組（Model組）、antagomir陰性對照組（antagomir-NC組）和miR-33 antagomir組（antagomir組），每組15只。除Sham組外，其他組大鼠均通過頸部氣管滴注10 mg/kg LPS建立ARDS模型［10］，而Sham組經頸部氣管滴注同體積的生理鹽水。若造模大鼠出現食欲下降，精神萎靡，呼吸急促等癥狀且氧合指數（OI）＜200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），說明ARDS模型構建成功，剔除不成功大鼠并及時補充。造模成功后，antagomir-NC組和antagomir組大鼠分別經尾靜脈注射80 nmol脂質體包被的antagomir-NC和miR-33 antagomir，注射體積為200μL，而Sham組和Model組大鼠經尾靜脈注射等量的生理鹽水，1次/周，干預2周后處死大鼠，取材檢測。

1.2.2 動脈血氧分壓［p（O2）］及OI檢測 充分麻醉大鼠后，打開腹腔，暴露腹主動脈，用含肝素鈉的注射器抽取1 mL主動脈血，采用血氣測定試劑盒和PT1000血氣分析儀檢測p（O2）和OI，OI=p（O2）/吸入氣中的氧濃度分數（FiO2）。

1.2.3 HE及Masson染色 處死大鼠后取肺組織，用生理鹽水沖洗，置于10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，制成約3μm厚的切片，分別進行HE和Masson染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化和纖維化程度，其中Masson染色中膠原纖維顯示為藍色。

1.2.4 堿性水解法檢測Hyp含量 取適量肺組織，用生理鹽水沖洗后，加入適量的6 mol/L鹽酸于100℃下水解5 h，再按照Hyp檢測試劑盒操作說明測定Hyp含量。

1.2.5 ELISA檢測炎性因子水平 處死大鼠后，打開胸腔并結扎肺組織肺門，頸部氣管做“V”型切口后放入靜脈留置針套管，用500μL的0.9%NaCl溶液反復灌洗支氣管肺泡3次，收集肺泡灌洗液（BALF），4℃，3 000×g離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒操作說明測定BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子水平。

1.2.6 qPCR檢測miR-33及TGF-β1、膠原（Collagen）Ⅰ和CollagenⅢmRNA水平 采用miRNA提取分離試劑盒提取肺組織中的miRNA，Trizol法提取總RNA，分別取2.0μg進行逆轉錄反應，以cDNA為模板進行qPCR反應。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。采用20μL反應體系，95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環。miR-33以U6為內參對照，TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA均以GAPDH為內參對照，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達水平。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測肺組織中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、α-SMA蛋白表達水平 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液處理肺組織提取總蛋白，用BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量。將等量的蛋白質加載到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上，然后通過濕轉法轉移到聚偏氟乙烯膜上，將膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入TGF-β1抗體（1∶1 000）、Smad2抗體（1∶1 000）、p-Smad2抗體（1∶2 000）、Smad3抗體（1∶1 000）、p-Smad3抗體（1∶2 000）、α-SMA抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），4℃下孵育過夜，然后加入HRP標記的山羊抗兔lgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h，再次沖洗后，將膜放置于凝膠成像系統中，加入200μL ECL顯色液覆蓋膜表面，顯影拍照，使用Image 6.0軟件計算各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參對照計算各蛋白相對表達水平，蛋白磷酸化水平用磷酸化蛋白和各自的總蛋白之間的比率表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠p（O2）及OI比較 與Sham組比較，Model組大鼠p（O2）和OI均降低（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠p（O2）和OI升高（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of p(O2)and OI between the four groups of rats表2 各組大鼠p（O2）及OI比較（n=15，mmHg，±s）

Tab.2 Comparison of p(O2)and OI between the four groups of rats表2 各組大鼠p（O2）及OI比較（n=15，mmHg，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F p（O2）97.73±7.49 68.11±1.99a 69.60±1.55a 80.24±1.91abc 33.845＊＊OI 459.30±21.27 158.94±18.48a 157.19±13.64a 268.27±22.52abc 162.902＊＊

Fig.1 HE staining and Masson staining of lung tissue(×200)圖1 肺組織HE染色及Masson染色（×200）

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化比較 見圖1。HE染色結果顯示，Sham組無明顯肺泡結構損傷、炎癥或出血；Model組和antagomir-NC組大鼠肺組織損傷嚴重，肺泡間隔明顯水腫增厚，炎性細胞浸潤，紅細胞增多，肺泡結構不完整，部分肺泡間隔破裂；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織炎性細胞浸潤、出血、肺間質腫脹明顯減少，肺組織損傷明顯改善。Masson染色結果顯示，Sham組大鼠肺泡結構完整且無明顯的膠原纖維沉積；與Sham組比較，Model組和antagomir-NC組大鼠肺泡結構被破壞且肺間質明顯有大量藍色膠原纖維；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠藍色膠原分布明顯減輕。

2.3 各組大鼠肺組織中Hyp含量比較 Sham組、Model組、antagomir-NC組和antagomir組大鼠肺組織中Hyp含量（μg/g）分別為412.04±31.92、812.67±28.67、810.63±38.51和537.68±29.04，組間比較差異有統計學意義（n=15，F=116.472，P＜0.05）。與Sham組比較，Model組大鼠肺組織中Hyp含量升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中Hyp含量降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均降低（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokinesin in lung tissue between the four groups of rats表3 各組大鼠肺組織中炎性因子水平比較（n=15，ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of inflammatory cytokinesin in lung tissue between the four groups of rats表3 各組大鼠肺組織中炎性因子水平比較（n=15，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F IL-1β 28.70±8.30 61.56±11.72a 60.79±8.85a 39.83±2.23bc 10.859＊＊IL-6 41.84±10.71 158.18±24.13a 157.15±35.72a 88.64±12.92abc 18.017＊＊TNF-α 107.51±19.57 431.92±23.58a 430.37±16.17a 288.11±23.74abc 160.420＊＊

2.5 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達水平均升高（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達水平均降低（P＜0.05）。見表4。

2.6 各組大鼠肺組織中TGF-β1/Smad信號通路相關蛋白表達水平比較 與Sham組比較，Model組大鼠 肺 組 織 中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達水平均上調（P＜0.05）；與Model組和antagomir-NC組比較，antagomir組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達水平均下調（P＜0.05）。見圖2，表5。

Tab.4 Comparison of the expression level of miR-33 and mRNA expression levels of TGF-β1,CollagenI and CollagenⅢbetween the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達水平比較（n=15，±s）

Tab.4 Comparison of the expression level of miR-33 and mRNA expression levels of TGF-β1,CollagenI and CollagenⅢbetween the four groups of rats表4 各組大鼠肺組織中miR-33及TGF-β1、CollagenI和CollagenⅢmRNA表達水平比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F miR-33 1.00±0.27 2.21±0.26a 2.21±0.20a 0.08±0.02abc 71.948＊＊TGF-β1 1.01±0.05 2.18±0.24a 2.15±0.21a 1.38±0.17abc 30.299＊＊CollagenⅠ1.00±0.07 1.80±0.17a 1.80±0.15a 1.46±0.06abc 29.265＊＊CollagenⅢ1.00±0.09 1.97±0.21a 1.94±0.12a 1.35±0.11abc 34.497＊＊

Fig.2 Western blot assay of TGF-β1,Smad2,p-Smad2,Smad3,p-Smad3 andα-SMA in lung tissue of rat in each group圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和α-SMA蛋白印跡圖

3 討論

ARDS是急性肺損傷的一種危險并發癥，具有很高的發病率和病死率。ARDS的主要病理特征是肺纖維化，ARDS肺纖維化是由肺部炎癥和細胞外基質的反復破壞和修復引起的持續性肺泡損傷，臨床表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫［11］。在ARDS過程中，當肺部受到感染或創傷時，炎癥通路就會被激活。炎癥反應有助于清除病原體，但過度的炎癥也會導致肺泡損傷和肺泡水腫液的積累，ARDS肺泡水腫液中含有高水平的炎性細胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1等，當細胞因子水平過高時，可誘導上皮細胞向成纖維細胞轉化，引起肺泡損傷，并伴有Hyp和膠原含量增加，發生纖維化沉積，發展成肺纖維化，最終導致急性呼吸衰竭［12］。即使在最大支持容許性高CO2通氣和體外膜氧合的治療情況下，ARDS患者仍表現出肺功能不可逆的惡化［13］，目前還沒有可以完全改善ARDS肺纖維化的治療方法。

Tab.5 Comparison of protein expression levels of TGF-β1,p-Smad2/Smad2,p-Smad3/Smad3 andα-SMA in lung tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達水平比較（n=15，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of TGF-β1,p-Smad2/Smad2,p-Smad3/Smad3 andα-SMA in lung tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達水平比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與Model組比較，c與antagomir-NC組比較，P＜0.05。

組別Sham組Model組antagomir-NC組antagomir組F TGF-β1 0.31±0.05 0.75±0.07a 0.74±0.05a 0.37±0.02bc 61.722＊＊p-Smad2/Smad2 0.32±0.03 0.87±0.10a 0.87±0.11a 0.56±0.10abc 26.354＊＊p-Smad3/Smad3 0.41±0.06 0.79±0.06a 0.79±0.07a 0.61±0.06abc 23.452＊＊α-SMA 0.21±0.02 0.49±0.05a 0.50±0.07a 0.30±0.04bc 22.852＊＊

miR-33是一種非編碼RNA，也是M1巨噬細胞表型的炎性介質。研究發現miR-33的表達與IL-6和TNF-α等炎性因子含量呈正相關，miR-33抑制劑可以促進巨噬細胞從M1表型分化為M2表型并減少THP-1細胞中IL-6和TNF-α等炎性因子的表達［14］。同時miR-33也被認為是一種促纖維化miRNA［15］。有研究報道，miR-33參與了肝臟動脈粥樣硬化病變和纖維化反應的炎癥過程［16］。Yu等［17］通過基因敲除發現miR-33a的缺失可通過抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，從而抑制心肌成纖維細胞的增殖和纖維化。然而抑制miR-33表達可否改善ARDS肺纖維化尚不清楚。因此，本研究構建LPS誘導的ARDS大鼠肺纖維化模型，采用miR-33 antagomir通過與miR-33靶向互補來沉默miR-33，探討抑制miR-33表達對ARDS大鼠肺纖維化的影響及其作用機制。結果顯示，Model組大鼠中p（O2）和OI均降低，肺組織中Hyp含量升高，HE染色和Masson染色結果也顯示肺組織損傷和纖維化嚴重，表明ARDS造模成功。抑制miR-33表達后ARDS大鼠中p（O2）和OI升高，Hyp含量降低，且肺組織損傷和纖維化情況明顯改善，說明抑制miR-33表達可改善ARDS大鼠肺纖維化。

TGF-β1/Smad信號通路被認為是組織纖維化的主要調節因子，有助于肌成纖維細胞的激活和膠原蛋白等細胞外基質的過度生成，從而促進組織纖維化的形成［18］。TGF-β1激活的Smad信號通路可使Ⅰ型受體介導的Smad2和Smad3磷酸化，從而增加CollagenⅠ和CollagenⅡ等纖維化相關基因以及IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子的表達［19］。TGF-β1/Smad信號通路在ARDS肺纖維化過程中發揮著關鍵作用［20］。TGF-β1可促進LPS誘導的ARDS大鼠早期肺纖維化的發展［21］。抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活可以有效改善組織纖維化。Mu等［22］研究發現，肝素能有效抑制TGF-β1和p-Smad2、p-Smad3的表達從而減輕LPS誘導的急性肺損傷。研究發現白藜蘆醇可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路改善LPS誘導的ARDS肺纖維化［23］。本研究進一步對抑制miR-33表達改善ARDS大鼠肺纖維化的作用機制是否與TGF-β1/Smad信號通路有關進行探討。結果發現，ARDS大鼠BALF中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達升高，說明有嚴重的炎癥反應，肺組織中TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達水平及TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3和α-SMA蛋白表達水平均升高，表明TGF-β1/Smad信號通路處于激活狀態。抑制miR-33表達后TGF-β1/Smad信號通路被抑制，炎癥反應也明顯減輕。因此，抑制miR-33表達后ARDS大鼠肺纖維化的改善可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活有關。

綜上所述，抑制miR-33的表達可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活，減少炎性因子的產生和異常膠原表達和分布，從而減輕LPS誘導的ARDS大鼠肺損傷和肺纖維化，miR-33表達抑制劑可能成為ARDS肺纖維化患者的一種新的治療選擇，但miR-33與TGF-β1/Smad信號通路分子之間的具體作用關系以及miR-33在ARDS發病機制中的作用尚需進一步研究。