瀉白散治療急性肺損傷作用機制的網絡藥理學研究*

陶 旺 陳金秀 陳 聰 吳 湘

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000；3.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510000）

急性肺損傷（ALI）是由各種肺內外致病因素引起的以肺泡上皮細胞和肺內毛細血管通透性增加，導致肺間質及肺泡彌漫性水腫，臨床主要表現為咳嗽、進行性呼吸困難等一系列肺部感染及低氧血癥［1］。中醫典籍中并無ALI的記載，根據其臨床表現可歸為“咳嗽”“喘證”等范疇。其病機關鍵在于熱毒壅肺、痰瘀互結；病理產物主要為痰、熱、水、瘀等，病性屬熱［2］。中醫藥多途徑多靶點的特點對于ALI的治療有獨特優勢。明代醫家李時珍［3］稱之為“瀉肺諸方之準繩”的瀉白散，出自北宋·錢乙《小兒藥證直訣·卷下諸方》。該方由桑白皮、地骨皮、甘草、粳米4味藥組成，是治療肺熱喘咳的經典方劑。方中君藥桑白皮，辛甘而寒，獨入肺經，不僅能清熱肅肺，尚可利水導火熱從小便而出，且氣薄質液不剛不燥，祛邪而不損正；臣藥地骨皮，甘寒入肺肝腎經，既助桑白皮清降肺中伏火，又養陰生津止渴，退骨蒸除五心煩熱；君臣相合，清肺熱養肺陰，以達金清氣肅之妙；甘草、粳米護胃調中，補脾益肺以培土生金，共為佐使藥，使瀉白散瀉肺而不傷正，寒涼而不傷胃［4］。網絡藥理學是從基因靶點層面分析中藥復方活性成分與疾病多靶點之間的相互作用，通過檢索數據庫以構建“藥物-疾病-靶點”的網絡圖，并預測其治療疾病的有效成分和機制通路。故本文通過網絡藥理學分析，篩選瀉白散治療ALI的相關分子機制，以期為瀉白散治療ALI提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 瀉白散相關靶點篩選 在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫［5］中，以“桑白皮”“甘草”和“地骨皮”為關鍵詞檢索相關有效成分信息，并以類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件對有效成分進行篩選。篩選結束后，在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）蛋白數據庫中，限定物種為“Homo sapiens”，將所有靶點轉化為基因名稱，并剔除重復及無法檢索的靶點，獲得中藥有效成分靶點。

1.2 ALI相關靶基因的確定 Genecards數據庫自動整合了約150個網絡資源的基因中心數據，包括基因組、蛋白質組、臨床和功能信息。為獲取疾病相關基因靶點，在Genecards數據庫（https：//www.genecards.org/）中，以“acute lung injury”為檢索詞進行檢索，獲得ALI疾病基因靶點。

1.3 瀉白散與ALI疾病的PPI網絡構建 為明晰瀉白散相關靶點與ALI疾病靶點的相互作用，利用Venny 2.1取瀉白散相關靶點與ALI疾病基因靶點的交集。進而將兩者共同靶基因輸入Cytoscape3.7.2中，借助bisogenet插件繪制瀉白散成分-ALI靶點的PPI網絡圖，運用CytoNCA插件對該PPI網絡進行相關拓撲分析，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）以及緊密度（Closeness），獲得瀉白散作用于該疾病的潛在蛋白質靶點，再分析其發展過程中的作用。

1.4 功能與通路的富集分析 Metascape平臺為實驗生物學家提供了全面的基因列表注釋和分析資源［6］。將瀉白散治療ALI疾病的潛在基因導入Metascape平臺，設置P＜0.01，分析可能的生物學過程和代謝通路并進行富集分析，將相關數據用微生信平臺進行可視化。

2 結 果

2.1 瀉白散與ALI疾病相關靶點的獲取 見表1。共獲得桑白皮的有效成分32個，甘草的有效成分92個，地骨皮的有效成分13個。按照OB值大小排列，表1展示了排名前15的活性成分。從Genecards數據庫中共獲得223個疾病基因靶點，score值越高則代表該靶點與疾病聯系越密切。

表1 瀉白散的活性成分（排名前15）

2.2 瀉白散有效成分網絡圖的構建 利用Cytoscrape 3.7.2構建“瀉白散-有效成分-靶點”網絡圖（如圖1），節點之間的連線代表藥物與有效成分、有效成分和靶點之間的關系。有效成分對應的靶點越多，其形狀也越大。圖中A2、A3、B1為瀉白散中聯系最緊密的活性成分，分別為“quercetin槲皮素”“kaempferol山柰酚”“naringenin柚皮素”。基因序列MOL004328、MOL000449、MOL012681、MOL000296、MOL001792、MOL000239 所代表的基因靶點之間節點最多，連接最緊密，可能為瀉白散發揮主要作用的關鍵靶點。

圖1 瀉白散-有效成分-靶點

2.3 瀉白散成分-ALI靶點網絡圖構建 用Venny 2.1對活性成分靶點與ALI靶點取交集后，共得到194個共同靶點，即為瀉白散治療ALI的潛在靶點，包括PTGS1、CHRM3、SCN5A、PIK3CG等（如圖 2）。使用Cytoscape3.7.2將瀉白散與ALI的共同靶基因輸入bisogenet插件中，繪制瀉白散成分-ALI靶點PPI網絡圖，得到初始PPI網絡共1 779個節點，58 260條邊，節點（node）代表活性成分、靶點、藥物及疾病名稱。邊（edge）代表各中藥與活性成分、活性成分與靶點、疾病與靶點的相互作用關系。運用CytoNCA插件對該PPI網絡進行相關拓撲分析，以 Degrees＞56，Betweenness＞1 241.2212，Closeness＞0.086289056為篩選條件進一步精簡PPI網絡，得到339個節點，11 464條邊，再進行二次篩選得到160個節點、3 958條邊的PPI核心網絡（如圖3）。最終篩選得出6個核心靶點（如圖4），藥物與ALI相關核心蛋白包括 NPM1、TP53、COPS5、MCM2、CUL1、CUL3（如表2）。

表2 瀉白散治療ALI關鍵靶點（排名前5）

圖2 瀉白散活性成分靶點與ALI靶點venn圖

圖3 PPI網絡拓撲分析

圖4 PPI網絡精簡圖

2.4 靶點功能與通路的富集分析 運用Metascape平臺對瀉白散治療ALI疾病相關靶點進行信號通路分析，借助微生信平臺進行數據可視化。瀉白散治療ALI疾病潛在通路主要包括靶向腫瘤細胞凋亡通路（Pathways in cancer）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK信號通路）、FoxO轉錄因子信號通路、cAMP信號通路、急性髓性白血病（acute myeloid leukemia通路）以及JAKSTAT信號通路、AMPK信號通路等（見圖5），與調控炎癥反應、抗氧化反應、介導細胞凋亡等功能密切相關。瀉白散主要參與的生物學過程有激素反應（response to hormone）、細胞對氮化合物的反應（cellular response to nitrogen compound）、對無機物的反應（response to inorganic substance）、細胞對脂質的反應（cellular response to lipid）、對外來刺激的反應（response to xenobiotic stimulus）等（見圖6）；相關靶點調節血脂的功能主要富集于DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白質結構域特異性結合（protein domain specific binding）、脂質結合（lipid binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）等。

圖5 瀉白散-ALI KEGG通路分析

圖6 瀉白散-ALI GO功能富集分析

3 討論

《小兒藥證直訣·卷下諸方》記載瀉白散“既可瀉肺之實熱，又可瀉肺之虛熱”，其配伍之妙主要在于桑白皮與地骨皮。首先，兩者一清一透：桑白皮以清透為主，性寒能清肺熱，辛又透肺中郁火，兼益元氣固本；地骨皮既清實熱又清虛熱，兩藥配伍使之清而不傷正，透而不郁，滋而不膩。其次，兩者一氣一血：桑白皮走氣分，清泄肺部實熱；地骨皮走氣血兩分，王好古謂其能“降肺中伏火，清胞中火，退熱”；又清血分之熱，清熱涼血止血，防肺熱灼傷血絡出血。最后，兩皮配伍法：清代《成方便讀·卷三》所言“桑白皮皮能行皮，根者入土最深；地骨皮直入黃泉，涼血退蒸”。邪氣多從皮毛而入，郁閉肺氣使肺失于宣降，皮能散表，故二皮運用取其象形思維，更有利于宣散邪氣、暢達氣機，可用于治療肺中伏火所致皮膚蒸熱、日晡尤甚之皮膚病。《本草害利》曰“地骨皮甘淡而寒，涼血清三焦，降肺中伏火，用地骨皮走表又走里”。中醫學認為，ALI的臨床表現與《黃帝內經》記載“故肺病者，喘息鼻張”“肺高者上氣，肩息咳”相類似，在病機上與“熱毒壅肺、痰瘀互結”密不可分。桑白皮與地骨皮兩者配伍不僅散外邪又清肺熱，表里兼顧；同時氣血兩清，防瘀血形成及出血等并發癥。故瀉白散對于治療ALI從理論角度有一定治療作用。

ALI的發病機制主要在于全身和肺內炎性細胞的持續激活、炎癥與抗炎癥介質的失衡以及氧化應激反應造成的一系列炎癥風暴，治療ALI首要關鍵是控制炎癥。藥理研究發現，瀉白散中桑白皮總黃酮、桑白皮苷能拮抗5-羥色胺和致炎介質組胺、抑制肥大細胞釋放炎性介質而起到抗炎作用［7］；地骨皮水提取物在脂多糖刺激小鼠巨噬細胞中可顯著降低脂多糖誘導的細胞內炎癥介質、一氧化氮、前列腺素E2和促炎細胞因子、白細胞介素-1（IL-1）和IL-6的生成，從而發揮抗炎作用［8］。在通過鼻腔滴入LPS誘發的肺部組織病變中，甘草黃酮抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的產生，而有顯著的改善作用［9］。通過網絡藥理學基于基因靶點層面進一步分析發現，瀉白散與ALI之間存在較多的共同靶點基因，網絡連接緊密，中藥活性成分以槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇連接最多。三者對ALI的炎癥反應及肺損傷均有保護作用，槲皮素［10］能抑制細胞凋亡和減少炎性細胞因子IL-6和TNF-α的產生；山柰酚［11］能夠抑制促炎因子 NF-κB、IL-1β、TNF-α等的表達；β-谷甾醇［12］可防止肺組織氣道炎癥的發生，具有良好的抗炎及免疫調節作用。PPI蛋白互做分析，核心蛋白涉及TP53、CUL3、MCM2等，研究者發現TP53、CUL3表達細胞的比例與炎癥強度相關，在ALI模型中CUL3、ERCC2、TP53等蛋白因子會顯著增加［13-14］。

交集基于KEGG通路分析Fox O家族參與調節細胞增殖分化、代謝及凋亡等多過程，與炎癥反應及氧化應激有關。何靖等［15］在脂多糖誘導的小鼠ALI模型中發現肺組織的FoxO1發生磷酸化，能上調肺組織中α亞基ENαC的表達，從而改善ALI的預后；絲裂原活化蛋白激酶（MAPK信號通路）主要包括p38 MAPK、ERK和JNK 3條經典的信號傳導通路，均參與炎癥因子的調控。侯帥紅等［16］發現在小鼠ALI模型中MAPK家族中p-p38、p-ERK和p-JNK蛋白表達量也明顯上升，說明MAPK信號通路與ALI的炎癥反應起著重要作用。JAK2/STAT3信號通路與細胞增殖、炎癥基因的調控密切相關［17］，石青青等［18］發現通過抑制該通路能有效抑制ALI觸發的炎癥反應，及時遏制炎癥風暴。

綜上所述，瀉白散雖藥物精簡，但配伍巧妙、內涵豐富，臨床上經加減廣泛運用于多系統疾病。從網絡藥理學基因靶點與生物信息相結合，預測瀉白散治療ALI的有效成分-靶點-通路機制，發現瀉白散可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效成分，與TP53、CUL3、MCM2等蛋白結合，通過MAPK、FoxO、cAMP或JAK-STAT等信號通路調節細胞代謝以及參與炎癥反應，從而一定程度上抑制ALI。研究結果也進一步論證中醫藥多途徑、多靶點治療疾病，這與中醫整體觀念和辨證論治也相符合，同時為中醫治療ALI提供參考與新思路。