基于網絡藥理學探討梔子豉湯治療反流性食管炎的作用機制

吳昊，許奎

安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230000

反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)是胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)的一種[1]，發病率逐年增高[2]，目前主要以質子泵抑制劑聯合促動力藥物治療[3]，但復發率較高。RE臨床表現與《傷寒論》梔子豉湯證相似，但梔子豉湯治療RE的機制尚不明確[4-7]。筆者以梔子豉湯為研究對象，以網絡藥理學為基礎，闡明梔子豉湯治療RE的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選以“梔子”“淡豆豉”為檢索關鍵詞，在中醫藥系統藥理學平臺(the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中進行中藥有效成分初篩，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，進行二次篩選，將最終獲取的作用靶點蛋白信息在Uniprot數據庫(https：//uniprot.org/)中進行標準化命名。

1.2 反流性食管炎靶點預測通過靶標數據庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[15]、人類基因數據庫(GeneCards?：the human gene database，https：//www.genecards.org/)[16]、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http//www.omim.org)、PharmGkb、DrugBank等5個數據庫，使用“reflux esophagitis”作為檢索詞獲取反流性食管炎的相關靶標，并去重后獲得疾病相關靶點數。

1.3 藥物-疾病交集靶點的網絡構建及可視化分析使用Draw Venny Diagram在線程序將藥物與RE疾病靶點取交集，并將交集基因導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建藥物與疾病靶點網絡圖，進行可視化分析。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將獲取的藥物-疾病靶點的交集基因導入到String(https：//string-db.org/，v11.0)在線網站，構建全部PPI，并再次利用Cytoscape 3.8.0篩選出核心蛋白互作網絡，構建核心蛋白互作PPI網絡圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)富集分析與京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析為了探討梔子豉湯對于反流性食管炎的主要作用通路，以及相關基因在通路中的作用，利用R語言軟件以P<0.05作為篩選條件對核心蛋白互作網絡進行GO生物富集分析以及KEGG通路富集分析。

2 結果

通過TCMSP檢索藥物有效成分，以“OB≥30%和DL≥0.18”作為篩選條件，刪除重復項后，共獲得18個化學成分、405個藥物作用靶點。在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank五個數據庫搜索相關靶標并去重取交集后，獲得疾病靶點數 2 076 個，見圖1。使用Draw Venny Diagram獲取藥物與反流性食管炎疾病靶點交集108個，見圖2。利用Cytoscape軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點網絡圖，圖中左側代表藥物的成分(紫色代表屬于梔子，紅色代表屬于淡豆豉)；右側藍色代表疾病靶點，靶點越大表明藥物對應靶點越多，見圖3。利用 STRING(https：//string-db.org/)數據庫構建全部蛋白互作關系，首先對PPI網絡圖設置置信區間為95%以上，并將全部蛋白互作關系導入Cytoscape軟件，再使用CytoNCA篩選出其中的核心蛋白，構建PPI網絡圖，見圖4。

圖1 疾病靶點Venn圖

圖2 藥物-疾病靶點交集Venn圖

圖4 藥物與反流性食管炎核心蛋白相互作用網絡圖(黃色代表藥物，藍色代表疾病)

通過數據庫 Bioconductor(http：//bioconductor.org/)對藥物治療反流性食管炎作用的靶標進行基因 symbol的ID轉換，運用R語言的ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2等程序包進行GO生物富集分析和KEGG通路富集分析，并繪制GO生物功能的氣泡圖和KEGG信號通路富集的柱狀圖(圖5、圖6)，GO生物富集分析涉及生物學過程BP共1 962個，細胞組分CC共48個，分子功能MF共154個。其中氣泡圖中氣泡的大小與富集基因數目呈正相關，主要涉及動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥等多個生物過程。以P<0.05作為篩選條件，共獲得KEGG通路富集得出155條信號通路，取前30條繪制柱狀圖。其中P值越小、顏色越紅，代表與藥物組合治療反流性食管炎關系越密切，主要涉及糖尿病并發癥、脂質和動脈粥樣硬化等多條信號通路。其中與糖尿病并發癥信號通路關系最為密切，其具體信號通路見圖7，紅色代表通路中相關的靶點。其中長度的長短與富集基因的多少呈正相關，顏色深淺與P值的大小亦呈正相關。

圖5 富集分析的生物過程氣泡圖

圖6 KEGG通路富集條狀圖

圖7 AGE-RAGE通路富集圖

3 討論

歷代醫家多認為反流性食管炎與肝氣犯胃，胃氣上逆有關，多采用疏肝理氣，降逆和胃法治療。RE具有反酸、燒心、胸骨后疼痛等臨床表現，與《傷寒論》梔子豉湯證相似。梔子豉湯由梔子、淡豆豉兩味藥組成。梔子苦寒，可清瀉三焦郁火，性降有宣；淡豆豉體輕氣寒，可開宣中焦痞結。梔子與淡豆豉相伍，可清泄胃中郁火，治療胃脘嘈雜，或胃脘疼痛不舒。然而目前梔子豉湯對反流性食管炎的作用機制尚不明確，筆者以網絡藥理學為基礎，從藥物成分、作用靶點及信號通路方面初步探索可能的作用機制。

依據本網絡藥理學統計，反流性食管炎的發生、發展與多個通路密切相關，而與AGE-RAGE通路關系最為密切，此通路中的激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子NF-κB(nuclear factor-κ appa B，κB)、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白等是中藥有效成分的研究熱點。AP-1是由Jun蛋白家族成員組成的二聚體，與炎癥密切相關，Zhang等[8]研究發現，抑制AP-1的轉錄活性，可抑制炎癥的發生；NF-κB與炎癥、細胞凋亡以及腫瘤的發生發展密切相關[9]；BCL-2蛋白家族與細胞凋亡密切相關[10]，而BCL-2蛋白主要是抗凋亡蛋白，可以抑制促凋亡蛋白活性，阻止細胞凋亡[11]；BAX蛋白可誘導細胞色素c的釋放，促進細胞凋亡[12]，且細胞的存活率與BCL-2/BAX的比值呈正相關[13]；白細胞介素類與細胞凋亡、炎性因子釋放、疼痛程度等密切相關。即梔子豉湯的藥物成分可能是通過阻斷AGE-RAGE通路中的p38信號，抑制轉錄因子 AP-1的激活，上調Bcl-2蛋白基因的表達，抑制Bax蛋白表達，從而拮抗細胞凋亡[13]，實現治療反流性食管炎的作用。

有研究表明，反流性食管炎的發生與血糖高水平密切相關，高血糖癥可導致血管內皮慢性炎癥，損害食管深層感覺神經，使食管的敏感度降低，導致反流性食管炎發生[14-15]。2型糖尿病患者更容易出現食管反流癥狀，可能與2型糖尿病的消化系統并發癥胃輕癱有關[16]。除此之外，2型糖尿病還是胃食管反流病的獨立危險因素[17]。淡豆豉中的有效成分豆豉多糖(glycitein)可通過AGE-RAGE通路影響胰島素受體糖代謝，從而修復糖尿病患者的腎臟及胰腺，達到降低血糖的作用[18]，進而通過抑制炎性基因PTGS1的表達來抑制反流性食管炎的發生。淡豆豉的另一成分大豆異黃酮(Isoflavon)可上調Bcl-2蛋白基因的表達，抑制Bax蛋白表達[19]，最終抑制執行細胞凋亡的CASP3基因。除此之外，大豆異黃酮可調控腸道菌群[20-21]，而反流性食管炎的發生與胃腸道菌群紊亂密切相關[22]。因此，維持腸道菌群的穩定對于反流性食管炎的治療至關重要。梔子的有效成分之一西紅花酸(crocetin)可使Bcl-2/Bax比值升高，抑制CASP8的活化，進而抑制CASP3的表達，使細胞趨于存活[23]。除此之外，西紅花酸還有阻斷NF-κB信號通路、促進細胞凋亡、釋放炎性因子的作用[24]；梔子另外的成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)可分別通過抑制p38及NF-κB信號通路的激活來抑制白細胞介素類炎性因子的釋放[25-29]；槲皮素以及山柰酚還可以調節機體血糖水平，進而抑制炎性因子的釋放[30]。槲皮素還可以通過抑制NF-κB和MAPK信號通路的激活，抑制炎性因子的分泌，進而改善機體的神經性疼痛[31-32]。梔子的另外成分甘露醇可促進TNF-α等炎性介質隨尿液排出，降低機體內炎癥因子的水平[33]。

綜上所述，梔子豉湯中的各藥物可能主要是通過調控機體血糖水平，抑制p38、NF-κB信號通路的激活，抑制炎癥因子的分泌，實現治療反流性食管炎的作用。