基于網絡藥理學及分子對接技術探討四逆散治療勃起功能障礙的作用機制*

蔚文垚，曹繼剛，鄧超，姜興宇，任方楠

湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指陰莖持續不能達到和/或維持足夠的硬度滿足正常的性生活3個月以上[1]。ED的發生與年齡、軀體疾病、精神心理因素、不良生活方式等相關，雖不危及生命，但影響著生活質量、夫妻關系等，也可能預示著某些疾病的發生。流行病學調查顯示，我國山東省ED總患病率為25.8%，40歲及以上人群的患病率為33.83%，且隨其年齡增長而上升，60歲以上上升幅度尤為明顯[2]；東莞市一項流行病學調查顯示，1 812例男性中，ED患病率為64.2%[3]，40歲及以上人群的患病率為40.2%[4]。目前，西醫治療ED的手段主要包括激素類藥物、非激素類口服藥物(如溴隱亭、曲唑酮、西地那非等)、外用藥物、負壓吸引縮窄裝置等，但仍存在安全性和不良反應等問題。

中醫將ED歸屬于“陽痿”范疇，認為本病基本的病機為肝郁、腎虛、濕熱、血瘀，臨床辨證中實多虛少[5]。四逆散源于《傷寒論》，記載：“少陰病……或瀉利下重者，四逆散主之”，本方包括柴胡、白芍、枳實、甘草四味中藥，以疏肝行氣為主，臨床多用于治療咳嗽、心悸、腹痛、泄瀉等疾病[6-8]。《靈樞·經脈》：“肝者筋之合也，筋者聚于陰器。”《素問·痿論》云：“筋痿者，生于肝，使內也。”指出肝主筋，合于陰器，陽痿不用當責之于肝，而四逆散以疏肝理氣為主，與陽痿治療觀念不謀而合。郭漢林認同王琦教授“陽痿從肝論治”學術觀點，并運用四逆散加味治療81例陽痿患者，有效率達83.5%[9]。王世勛運用四逆散加減治療陽痿患者56例，有效率達85.7%[10]。日本漢方醫家細野氏認為四逆散所治之人，性格內向、消極、敏感，與陽痿之人多焦慮、抑郁等不謀而合，因此，四逆散亦能兼治陽痿患者的情志病[11-12]。

中醫用藥多為復方制劑，雖然歷史悠久、療效明顯，但中藥成分復雜，難以明確其有效成分和作用機制。網絡藥理學是在網絡大數據的基礎上，從生物網絡整體角度系統地分析藥物的成分、靶點及對疾病的作用機制，是將傳統醫學與現代生物學結合的研究[13]。基于此，本研究通過網絡藥理學及分子對接的方法構建四逆散治療ED的藥物成分-靶點-疾病網絡圖，探索四逆散治療ED的作用機制，為后續深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 四逆散活性成分及其作用靶點搜集利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php)[14]分別檢索四逆散組方中藥柴胡、白芍、枳實、甘草的化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出藥物的活性成分，并提取藥物活性成分的相關靶點。以Uniprot數據庫(http：//www.uniprot.org)對靶點的名稱進行標準化，并運用Cytoscape3.9.1軟件可視化“四逆散-活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 四逆散治療ED的潛在靶點預測利用治療靶標數據庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[15]、人類基因數據庫(GeneCards?：the human gene database，https：//www.genecards.org/)[16]、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http//www.omim.org)[17]、DisGeNET 數據庫(https：//www.disgenet.org)[18]，以“erectile dysfunction”為關鍵詞篩選出疾病靶點，將4個數據庫獲得的疾病靶點合并后刪除重復值得到ED相關靶點。通過Venny2.1.0將藥物活性成分靶點與ED相關靶點進行映射，取交集，即為四逆散治療ED的潛在靶點。將交集靶點與對應的藥物活性成分導入Cytoscape3.9.1軟件，構建“四逆散-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖并進行拓撲分析。

1.3 潛在靶點蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡分析將潛在靶點導入STRING數據庫(https：//cn.string-db.org/)[19]，設置物種為“Homo sapiens”，minimum required interaction score：high confidence(0.700)，構建PPI網絡，并利用Cytoscape軟件中CytoNCA插件[20]進一步分析，根據度值(degree，DC)、中介中心性(betweenness，BC)、接近中心性(closeness，CC)、特征向量(eigenvector，EC)等參數篩選PPI網絡核心節點，大于2倍DC中位數且同時大于BC、CC、EC中位數的節點為核心節點，即核心靶點。將核心靶點導入STRING數據庫，構建核心靶點的PPI網絡，利用Cytoscape3.9.1可視化。

1.4 核心靶點的生物學功能及分子通路分析將核心靶點通過Metascape數據庫(https：//metascape.org/gp/index.html)進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選條件Min Overlap為3；PValue Cutoff為0.01；Min Enrichment為1.5[21]，并用微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)可視化分析結果。

1.5 分子對接選擇“四逆散-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖中degree值排名前5位的活性成分，通過TCMSP數據庫導出活性成分的mol2格式，使用Autodock軟件對活性成分進行加全氫、設為配體、檢測扭轉鍵、選擇扭轉鍵等處理。通過RCSB PDB數據庫(http：//www.rcsb.org)導出PPI網絡中排名前5位的核心靶點的蛋白晶體結構，利用Pymol軟件對其去水、清除配體后保存為pdb格式，使用Autodock軟件對蛋白質加全氫，導出為PDBQT格式。設置對接參數及運算方法為默認值，運行Autodock進行分子對接并查看對接結果。通過配體與受體的結合能評價活性成分和核心靶點間的對接效果，結合能<-1.2 Kcal·mol-1為對接狀態良好，并再次利用Pymol可視化分子對接結果。

2 結果

2.1 四逆散活性成分及其作用靶點利用TCMSP獲得柴胡活性成分13個，相關靶點182個；白芍活性成分8個，相關靶點86個；枳實活性成分18個，相關靶點116個；甘草活性成分88個，相關靶點221個；其中重復活性成分7個，重復靶點356個，去重后共獲得120個活性成分及249個相關靶點，見表1。將篩選的藥物活性成分與預測靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件，構建“四逆散-活性成分-靶點”網絡圖。該圖包含373個節點(4味中藥，120個活性成分，249個預測靶點)，2 093條邊，其中藍色圓形代表藥物，橙色平行四邊形代表柴胡活性成分，紫色代表甘草活性成分，紫紅色代表枳實活性成分，橙色三角形代表白芍活性成分，綠色箭頭形代表共有活性成分；藏青色圓形代表相關靶點。見圖1。

表1 四逆散組方中藥活性成分及預測靶點數目

圖1 “四逆散-活性成分-靶點”網絡圖

2.2 四逆散治療ED的作用靶點以“erectile dysfunction”為關鍵詞在GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET數據庫中檢索ED疾病靶點，合并并去除重復值后得到1 846個ED疾病相關靶點。將ED疾病相關靶點與四逆散活性成分靶點映射，取交集，得到156個四逆散治療ED的作用靶點，并用韋恩圖進行可視化。見圖2。將交集靶點與對應的藥物活性成分導入Cytoscape3.9.1軟件，構建“四逆散-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖。該網絡圖共有278個節點(4個中藥節點，1個疾病節點，156個靶點節點，117個活性成分節點)和1 699條邊，圖中橙色大圓形代表潛在靶點，黃色六邊形代表藥物，紅色三角形代表甘草活性成分，藍色平行四邊形代表枳實活性成分，紫紅色正方形代表柴胡活性成分，藍色箭頭形代表白芍活性成分，藍色圓形代表疾病，綠色菱形代表共有活性成分，藍色正方形代表共有活性成分標記。網絡拓撲分析篩選出排名前5位的活性成分分別是槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、山柰酚(MOL000422)、芒柄花素(MOL000392)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(MOL003896)。見圖3及表2。

2.3 潛在靶點PPI網絡將156個潛在靶點導入STRING數據庫，構建PPI網絡，并導出分析數據，利用Cytoscape3.9.1對結果進行可視化，并用CytoNCA進行拓撲分析得出，DC中位數為15，EC中位數為0.05，BC中位數為84.72，CC中位數為0.43，篩選出大于2倍DC中位數且大于EC、BC、CC中位數的靶點共23個，排名前5位的核心靶點分別是絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、轉錄因子AP-1(AP-1 transcription factor subunit，JUN)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、腫瘤抗原p53(tumor protein p53，TP53)。將23個核心靶點導入STRING數據庫，構建核心靶點的PPI網絡，并利用Cytoscape進行可視化。圖中顏色越紅、透明度越小、面積越大的靶點則其degree值越大，說明該靶點與其他靶點相關度越高。見圖4，圖5及表2。

圖2 四逆散活性成分靶點與ED疾病靶點韋恩圖

圖3 “四逆散-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖

圖4 四逆散治療ED的潛在靶點PPI網絡

圖5 四逆散治療ED的核心靶點PPI網絡

2.4 核心靶點GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析通過Metascape數據庫對23個核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO功能富集分析得到719個生物過程(biological process，BP)，18個細胞組分(cellular component，CC)及41個分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、對活性氧的反應(response to reactive oxygen species)、腺體發育(gland development)等；CC主要涉及轉錄調節復合物(transcription regulator complex)、轉錄抑制復合物(transcription repressor complex)、RNA聚合酶II轉錄調節復合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)等；MF主要涉及DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、轉錄因子結合(transcription factor binding)等。將結果分別按照P值排序，使用微生信繪制出前10個結果的柱狀圖。見圖6。KEGG信號通路富集分析得到149條信號通路，主要涉及脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、癌癥通路(pathways in cancer)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等。用微生信繪制出前20條信號通路氣泡圖。見圖7。

表2 排名前5位的活性成分及核心靶點信息

圖6 四逆散治療ED核心靶點的GO富集分析

2.5 分子對接通過AutoDock軟件對degree值排名前5位的活性成分及核心靶點進行分子對接，其中活性成分配體與核心靶點蛋白質受體結合活性越高，其結合能值越低。通過RCSB PDB數據庫選取核心靶點AKT1、TP53、MAPK3、STAT3、JUN的蛋白晶體結構。AutoDockTools設為默認值，將各成分與靶點加氫后進行分子對接，結果發現，四逆散活性成分與核心靶點對接良好。見表3及圖8。

圖7 四逆散治療ED核心靶點的KEGG富集分析

圖8 四逆散活性成分與核心靶點分子對接示意圖

表3 四逆散治療ED的活性成分與核心靶點分子對接結果 ( Kcal·mol-1)

3 討論

陰莖勃起是一種神經血管現象，解剖發現陰莖海綿體3/4是由血管結締組織組成，組織間有復雜且相互連接的腔隙，相當于一種單一的血液儲存器，當受到刺激時，腔隙組織松弛，腔隙擴大，小動脈擴張，從而使得陰莖海綿體內血管壓力降低，動脈血液內流增多；而腔隙擴大又壓迫其壁及白膜間的小靜脈，周圍白膜張力增大牽拉，導致靜脈受壓回流受阻，陰莖海綿體入血量增加、出血量減少及白膜的限制使得陰莖勃起增粗，硬度增強。陰莖疲軟時，腔隙變小，靜脈受壓減小，小靜脈出血量增加。血管病變是ED發生的重要病理機制，血管內皮慢性損傷、高血壓、動脈粥樣硬化、一氧化氮(nitric oxide，NO)/環磷酸鳥苷(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate，cGMP)通路受損等均可影響陰莖勃起功能[22-23]。陰莖正常勃起需要神經系統的調控，副交感神經系統可向陰莖傳遞興奮性神經沖動，促進其勃起，交感神經多控制陰莖的疲軟，作為神經遞質的NO在陰莖勃起機制中起到了重要作用。神經病變不僅會導致性刺激減弱，也會減少NO的合成[24]。中樞神經系統(central nervous system，CNS)控制陰莖勃起多涉及反射性刺激和心理性刺激兩方面，研究發現，心理性ED是最常見的一種ED類型，并且這種由心理因素引起的ED可以通過患者腦網絡分析得到證實，這對于深入理解心理因素誘導ED的發病機制有著重要的意義[25]。此外，內分泌紊亂也是ED的重要致病因素，腺體受損、代謝紊亂、低性腺激素、糖尿病等均可導致ED[26]。

中醫對陽痿的認識同中有異，如《素問·五常政大論》：“氣大衰而不起不用”，認為氣不足可導致陽痿不用；《諸病源候論》：“勞傷于腎，腎虛不能榮于陰器，故痿弱也”，認為過度勞作、腎虛不足會造成陽痿；現代部分中醫家認為本病與肝密切相關[27-30]。肝主藏血、主疏泄，陰莖正常勃起需要肝疏泄氣血于宗筋；肝主調暢情志，研究表明，心理因素是ED發生的重要危險因素[31]。從肝經在人體循行可知肝經入陰毛，環陰器；從肝生理特性可知，肝氣上升、主春，而春天孕育生機勃勃之勢，是萬物生長交配的季節，肝氣暢通、充足是陰莖正常勃起的先決條件。四逆散是治肝之方，由柴胡、白芍、甘草、枳實組成，其中柴胡體質輕清，性味辛、苦、微寒，能夠疏理肝氣、條達膽氣；白芍性味苦、酸、微寒，能夠養血和營、斂陰平肝，合甘草則酸甘化陰，合柴胡則理肝氣、清郁火；甘草性味甘平，能夠和中緩急、安魂定魄、補五勞七傷，治療一切虛損等；枳實性味苦、酸、微寒，破氣消積。肝與陽痿密切相關，臨床醫家采用四逆散治療陽痿，療效可觀，卻因中藥成分復雜、多靶點等問題導致作用機制不明[32-34]。

本研究共得到四逆散活性成分120個，作用于249個預測靶點，與ED疾病靶點取交集后獲得156個交集靶點，通過PPI分析及degree值預測后發現5種主要活性成分，分別是槲皮素、木犀草素、山柰酚、芒柄花素與7-甲氧基-2-甲基異黃酮。研究發現，槲皮素能顯著改善環孢素誘導的勃起功能障礙大鼠的性行為，提高ATP的生物利用度，調節核糖核酸酶及腺苷脫氨酶活性，提高NO水平，從而治療勃起功能障礙[35]。槲皮素亦能抑制磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase-5，PDE-5)、精氨酸酶、乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)和血管緊張素轉換酶(angiotension-converting enzyme，ACE)的活性，改善Fe2+和硝普鈉誘導的大鼠陰莖組織脂質過氧化[36]。有學者根據南瓜籽可治療ED研究了其對離體大鼠海綿體勃起功能關鍵酶的影響，發現南瓜籽能夠抑制PDE-5、精氨酸酶、乙酰膽堿酯酶和ACE活性，提取南瓜籽成分后發現，南瓜籽主要成分是槲皮素和木犀草素[37]。山柰酚是一種常見的黃酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化活性，并對心血管疾病具有保護作用。研究發現，山柰酚可降低氧化應激、心肌酶、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達[38]。雖然沒有直接的研究發現山柰酚可治療ED，但是由于陰莖的海綿體大部分由血管結締組織組成，推測山柰酚可通過修復血管間接改善陰莖的勃起功能。芒柄花素屬異黃酮類化合物，是植物雌激素，具有類雌激素、抗炎、抗腫瘤、抗血栓、抗凋亡等作用[39]。雌激素信號與陰莖發育有關，并潛在地參與成年時期調節勃起功能的過程[40]。回顧性研究發現，在多因素logistic回歸分析中，當控制血清總睪酮、年齡、體質量指數和吸煙狀況時，血清雌二醇的水平與臨床勃起功能障礙顯著相關[OR=1.52，95%CI(1.11-2.09)，P=0.009][41]。

PPI網絡及CytoNCA分析后發現排名前5位的核心靶點分別是MAPK3、STAT3、JUN、AKT1、TP53。研究表明，上調STAT3可促進脂肪間質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)向雪旺細胞(Schwann cells，SCs)分化從而有利于海綿體神經損傷后勃起功能的恢復[42]。AKT1是細胞內信號轉導的重要分子，上調動脈性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體AKT1的表達能夠改善血管內皮功能，促進陰莖勃起[43]。AKT1還能夠調節內皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthases，eNOS)磷酸化，維持NO水平，從而促進陰莖能夠持續勃起[44]。活性成分與核心靶點分子對接發現，其結合能均<-1.2 Kcal·mol-1，提示對接效果良好，且木犀草素與TP53結合能值最低，為-7.64 Kcal·mol-1。由此可知，四逆散治療ED具有多成分、多靶點的特點。

對四逆散治療ED的23個核心靶點進行GO富集分析發現，核心靶點主要涉及細胞對化學應激的反應、對活性氧的反應、腺體發育等生物過程，轉錄調節復合物、轉錄抑制復合物、RNA聚合酶II轉錄調節復合物等細胞組分，DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、轉錄因子結合等分子功能。研究表明，活性氧的增加不僅能夠降低NO的能力，也能刺激Ras同源蛋白家族成員A(ras homologous family member A，RhoA)/Rho激酶(Rho kinase，RhoK)途徑，造成ED[45]。轉錄因子的調節受損，如叉頭轉錄因子(forkhead transcription factor，FOX)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等，可導致血管內皮受損，從而引發勃起功能障礙[46-47]。

KEGG分析結果顯示，四逆散治療ED的23個核心靶點共涉及149條信號通路，主要與脂質和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、癌癥通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等信號通路相關性較強。研究發現，血脂異常可能是造成ED的危險因素[48]。動脈粥樣硬化是一種系統性疾病，可危及陰莖海綿體動脈，從而影響陰莖勃起功能[49]。MAPK信號通路與ED關系密切，MAPK調控著細胞增殖、分化、凋亡等多種途徑，并且其相關基因多樣，較熟悉的包括細胞外調節蛋白激酶(external-signal regulated kinase，ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)等，均可調節陰莖海綿體內皮、平滑肌、細胞凋亡等途徑，從而影響勃起功能[50-52]。PDE-5與環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)代謝相關，抑制PDE-5則能降低cGMP代謝成GMP，從而舒張陰莖海綿體，增強勃起。研究發現，PDE-5抑制劑可通過調控NO/cGMP信號通路降低直腸癌、骨髓瘤、乳腺癌等風險[53]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測四逆散治療ED的作用機制和核心靶點發現，四逆散的活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芒柄花素等可與MAPK3、STAT3、JUN、AKT1、TP53等核心靶點結合，通過調節脂質和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、癌癥通路等信號通路發揮改善勃起功能障礙的作用，具有多成分、多靶點、多通路的特點，為進一步的實驗驗證提供了參考。